化學交換飽和轉移衍生新技術的開發與臨床應用

李麗， 王振雄， 方紀成， 甘桐嘉， 申楠茜， Kejia Cai， 朱文珍

圖1 CEST技術成像原理及交換效應的測量方法[11]。

化學交換飽和轉移(chemical exchange saturation transfer，CEST)是一種新型的MRI分子成像技術，由Ward和Balaban提出[1]，可以反映內源性和外源性含有可交換的質子或生物分子濃度。CEST具有獨特的無創性、利用體內物質作為天然對比劑、無輻射等優點, 而且其成像原理靈活，受益面廣，可以檢測許多不同物質，使得CEST廣泛應用于各個系統，并由此衍生出部分新技術，用于各種生物大分子物質及環境因素[內源性活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[2]、脂肪[3]、pH值[4]、蛋白質及多肽[5]、葡萄糖(Glucose)[6]、谷氨酸(Glutamate)[7]、肌酸(Creatine)[8]、肌醇(myo-inositol)[9]及葡聚糖(glycosaminoglycan,GAG)[10]等]的檢測。根據CEST的基本原理及影響因素，多種CEST衍生新技術被開發出來，并應用于全身各個系統，用于測量各種物質在正常機體及疾病中的分布及其在病理生理過程中的作用。本文擬進一步闡述CEST衍生新技術的開發原理及其臨床應用，旨在推動CEST衍生技術的進一步創新研究開發及應用。

CEST的基本原理

CEST基本原理中最為經典的是二池理論，也是最為容易理解的。如圖1所示，兩次模型中包括小池(溶質池)和大池(自由水池)。溶質池(一些生物大分子、脂質體等)含有可交換質子，CEST技術利用選擇性射頻脈沖使可交換質子達到飽和狀態，通過化學交換作用將飽和效應傳遞給自由水池的水質子，從而引起水質子磁共振信號的降低，以此來獲得生物體內這些分子的相關信息，從而間接反映物質濃度[11]。圖1中以飽和酰胺質子NH為例，A圖和圖B顯示溶質中的質子(藍色)在被給與特定的飽和脈沖(8.25 ppm，此時水的特定位置為4.75)進行飽和。這些飽和的質子會與自由水中的質子(黑色)進行交換，形成交換速率(ksw)。經過足夠長的飽和時間后(tsat)，就可以檢測出水磁共振信號的減低。S0是指沒有進行飽和脈沖飽和時，測得的水的磁共振信號。Ssat是指進行飽和脈沖飽和后，測得的水的磁共振信號。C圖顯示將測得的Ssat進行標準化(Ssat/S0)，作為曲線的Y軸，以飽和頻率為X軸，即產生Z譜(或CEST譜或MT譜)。當以4.75 ppm的飽和脈沖飽和水質子時，水信號消失。這個頻率在Z光譜中被指定為0 ppm。因此，酰胺質子的波谷位置位于3.5 ppm。D圖顯示最常用的參量是非對稱磁化轉移率[magnetization transfer asymmetry (MTRasym)，MTRasym={Ssat(-Δω)-Ssat(Δω) }/S0，Δω為飽和的基團與水之間的頻率位置差]，通過消除水直接飽和(direct saturation，DS)的影響，獲取MTRasym譜。

Pankowska等[12]利用CEST技術，在7T MR 掃描儀上進行大鼠丘腦掃描，獲得體內的Z譜曲線(圖2),顯示不同體內物質在Z譜上的波谷位置。羥色胺類物質(5-羥色胺，色氨酸)位于5.4 ppm左右，酰胺類物質(蛋白，多肽)位于3.5 ppm左右，第一類胺類物質(GABA，谷氨酸，谷氨酸鹽)位于3.0 ppm，第二類胺類物質(磷酸肌酸，肌酸)位于2.0 ppm，胺和羥基類物質(肌醇，膽堿)位于0.8～1.0 ppm，NOE效應(脂質，脂肪族類)位于-1.6～-4.6 ppm。借此，可以根據不同物質的飽和頻率位置，進行選擇性飽和，從而間接反映測量物質的含量。根據飽和峰位置不同的不同基團，衍生多種基于基團的CEST技術，如酰胺質子轉移成像(amide proton transfer，APT)成像[5]、葡萄糖CEST成像(Gluco CEST)[6]、谷氨酸CEST成像(Glu CEST)[7]、肌酸CEST成像(Cr CEST)[8]、 肌醇CEST成像(MI CEST)[9]、葡聚糖CEST成像(gag CEST)[10]。

圖2 大鼠丘腦的體內Z譜圖：+6ppm到-6ppm頻率范圍之間的物質顯示[12]。 圖3 不同環境因素下，在7T場的磁共振掃描儀下獲取的Z譜曲線。a) pH值分別為5.0、6.0、7.0的Z譜； b) 溫度分別為25℃、37℃的Z譜[1]。 圖4 a) 不同B1場強(487、 606、 689、 833、 952、 1212Hz)下，溶液pH值為7，溫度為25℃，預飽和時間為10s，在9.4T場的磁共振掃描儀下獲取的Z譜曲線； b) 利用A圖生成Omega plot(y軸為Mz/(M0- Mz)，x軸為1/(ω1)2)。ω 為B1場強，利用公式可以計算出x軸截距[22]。

CEST效應的影響因素

基于CEST效應的原理， CEST效應對被飽和的質子濃度(體內固有質子或對比劑)，飽和質子與水質子之間的交換率，以及影響交換率的參數(如pH值、溫度、緩沖液濃度等)敏感[1]。除此之外，CEST效應還取決于弛豫速率、磁場強度，實驗參數包括重復時間、輻射頻率的強度及時長和方案[13]，以及圖像讀出方法這些設置參數[14-17]。van Zijl等[18]將200 mM的糖原溶液于相同的環境條件(37℃，pH=7.4)分別置于不同B0場(4.7T與9.4T)的磁共振掃描儀，發現9.4T中獲取的CEST效應所致的化學位移差更好。因此，B0場場強越高，越有利于CEST效應研究。而Sun等[13]通過研究發現輻射頻率的強度(RF power)受多因素的影響，包括B0場強、弛豫參數(弛豫速率，弛豫時長等)，同時頻率強度和時長對CEST效應的產生具有決定性作用[15-17]。此外，CEST效應對T1弛豫率(T1W)有較強的依賴性，而T2弛豫率(T2W)對CEST效應中的自由水的直接飽和DS發揮作用[14]。

圖5 突發腦梗塞患者，梗塞位置位于右側額頂葉，梗塞區域的Kex明顯高于對側對照(本院病例)。a) DWI圖; b) Kex圖。 圖6 間變型少突膠質細胞瘤(Ⅲ級)患者，腫瘤位于右側丘腦(本院病例)。a)T1WI圖像；b)T2WI圖像；c)T2 FLAIR加權圖像； d) DWI加權圖像； e) T1增強掃描圖像； f) Kex圖像。

圖7 典型的棕色脂肪(A)、白色脂肪(B)和肌肉(C)的Z譜曲線。水(藍色曲線)，脂肪峰(黃色曲線)，直接擬合的多洛倫茲函數曲線(紅色)[3]。 圖8 正常男性NCM (A)、 正常女性NCF (B)和PCOS患者PCOS(C)的水脂分數(FWF)圖，棕色脂肪(BAT)圖，白色脂肪(WAT)圖，肌肉(Muscle)圖[3]。

圖9 低級別膠質瘤的Cho峰的升高和NAA峰的降低均比高級別膠質瘤要輕，APT值輕度升高，Ki-67指數相對較小。高級別惡性膠質母細胞瘤，表現為明顯升高的Cho峰和降低的NAA峰，明顯升高的APT值以及高Ki-67指數[5]。a) 低級別膠質瘤；b) 高級別膠質瘤。

而在體內應用CEST觀察體內組織時，除了參數設置會影響CEST效應之外，組織本身的環境條件也會影響效應的測量。其中，最為重要的是組織的pH值及溫度，圖3顯示的是不同的pH值和不同溫度對CEST效應的影響[1]。因此，也可以基于pH值和溫度的影響，利用CEST效應測量組織內的pH值及溫度，探測疾病的病理生理過程[19]，由此衍生出pH mapping和Temperature mapping等新的技術。

CEST衍生新技術

1.內源性活性氧簇(ROS)磁共振(endogenous ROS MR)技術

根據不同輻射頻率的強度(B1場)產生不同的CEST效應，由此衍生出基于質子交換速率(proton exchange rate,Kex)的內源性ROS磁共振技術[2,20]。ROS MR可以檢測機體內的ROS，從代謝水平對體內組織進行成像。ROS包括超氧陰離子(.O2-)、羥自由基(.OH) 和過氧化氫(H2O2)等[21]。當組織內的 ROS含量增加時，會促進組織內物質中氫H質子與水中氫H質子的交換速率加快[20]。而CEST成像通過預飽和射頻脈沖激發物質基團中的質子，然后飽和磁化，再通過化學方法轉移到水體中，從而使得MRI檢測到的水體信號衰減，衰減后的信號通過飽和功率量化交換(QUantifying Exchange using Saturation Power，QUESP)計算出CEST中的質子交換速率Kex[2]。Shaghagh等[20]又利用Omega-plot方法計算Kex進行進一步優化。如圖4所示，不同B1場下生成的Z譜存在差異，取1/(ω1)2為x軸，Mz/(M0-Mz) 為y軸，生成Omega plot圖[22]，再利用公式(1),就可以計算出x軸截距，即1/(Kex)2，從而可以計算出Kex，

(1)

從而反映組織內的ROS含量。ROS MR可以較好地顯示正常志愿者的灰白質的Kex的不同，因為灰質的Kex明顯高于白質，可利用Kex可以很好地分割灰白質。同時，該技術已應用于腦卒中(圖5)與腦腫瘤(圖6)患者中。在腦卒中患者的研究中發現Kexmap可以很好地顯示梗塞區域，而且發現梗塞區域的Kex明顯高于對側對照，由此反映梗塞區域的ROS含量高于對側，相關研究仍在進行。而在腦腫瘤患者的研究中(圖6)Kex圖可清晰顯示間變型少突膠質細胞瘤的病灶，并顯示了外囊受累，但是與ROS含量的關系尚在研究中。

2.水脂分數(FWF) ZSI image水脂分數相關Z譜成像技術

相關研究證實，棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)通過產生熱量來改善葡萄糖耐量，增加胰島素敏感性，促進體重減輕，從而影響全身代謝[23]。然而，由于PET/CT 輻射量大，且只能顯示激活的棕色脂肪，使其的應用受到局限[24]。與白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)相比，棕色脂肪的含水量較高，而脂質含量相對較低[23]，因此水脂分數(fat water fraction，FWF)已成為棕色脂肪檢測的天然生物標志物[24]。MR中的Dixon技術和基于CEST的Z譜成像技術均可用于計算FWF和檢測體內棕色脂肪含量，但是Z譜成像克服了Dixon技術受水和脂肪信號直接飽和對相位偽影的固有敏感性這一缺陷，具有更明顯的優勢[24]。如圖7所示，基于棕色脂肪(BAT)、白色脂肪(WAT)、肌肉(Muscle)的Z譜曲線，可以較好地區分這三種組織。棕色脂肪具有中等大小的脂肪峰，中等大小的水峰；而白色脂肪具有較尖聳的脂肪峰，小而寬的水峰；肌肉具有大而寬的水峰，非常細小的脂肪峰。根據曲線的水峰和脂肪峰，可以根據公式(2)計算出FWF。

圖10 T2圖像上顯示，由上向下椎間盤的Pfirrmann分級依次為Ⅱ，Ⅰ，Ⅳ，Ⅰ級，等級越高，gag CEST越低。 圖11 a) T2WI圖像; b) 葡萄糖注入早期的AUC圖像; c)葡萄糖注入晚期的AUC圖像；d) 不同感興趣區的動態信號時間曲線，可以顯示腫瘤區域及對側的葡萄糖攝取情況。

圖12 顳葉癲癇的GluCEST-MRI表現。a、b) 右側顳葉無灶性癲癇患者,右側海馬GluCEST信號明顯增強； c、d)左側顳葉無灶性癲癇患者,左側海馬GluCEST信號明顯增強[28]。

(2)

然后，根據FWF的取值范圍，FWF大于0.7的組織，為白色脂肪；FWF小于0.4的組織，為肌肉；FWF介于0.4～0.7之間的為棕色脂肪[3]。通過上述標準，即可在脂肪組織內區分出白色脂肪和棕色脂肪。本研究團隊將FWF ZSI成像應用于正常女性、男性及多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者中，發現三者中正常男性具有較多的肌肉，正常女性具有較多的棕色脂肪，而PCOS患者具有較多的白色脂肪(圖8)。通過統計學分析發現正常男性與正常女性在棕色脂肪含量上沒有統計學差異，但是正常女性的棕色脂肪含量高于PCOS患者。正常男性的棕色脂肪活性最高，其次是正常女性，而PCOS患者的棕色脂肪活性受損。這一研究結果將有助于PCOS患者治療療效的監控，以及未來為以棕色脂肪為靶點的治療方案提供依據[3]。

3.酰胺質子轉移(APT)成像

酰胺質子轉移(amide proton transfer，APT)成像技術是CEST技術中應用最為廣泛，也是最為穩定和敏感的，主要應用于腦卒中與腫瘤。APT成像通過飽和酰胺基(-NH)中的質子，從而測定內源的游離蛋白質和多肽含量[5]。Sun等[25]將APT應用于腦卒中動物模型中，發現MTRasym能很好地顯示卒中病灶，并與CBF和ADC減低區相對應，且 DWI-APT錯配區可認定為缺血半暗帶，此區血流灌注降低且存在酸中毒， 如果不加干預，進一步會發展為梗死區。而APT-PWI錯配區僅灌注降低，并未出現酸中毒，為良性缺血區。根據APT技術，可衍生出內源性和定量pH加權的APT成像[26]，用于顯示腦缺血組織的pH值改變以及代謝紊亂。另外，APT技術也較多地應用于腦腫瘤。本研究團隊將APT技術應用于膠質瘤中，發現APT在高、低級別膠質瘤中有統計學差異，且與腫瘤級別和反映腫瘤增殖活性的Ki-67有很好的相關性[5](圖9)。此外，APT也被應用于其他系統的腫瘤及疾病中。

4.葡聚糖CEST成像(GAG CEST)

糖胺聚糖是軟骨組織的重要組成成分，含有1個-NH基與3個-OH基，可以作為內源性CEST對比劑，與水進行質子交換。利用GAG CEST可以對葡聚糖進行直接的測量及成像。Togao等[27]利用GAG CEST研究正常椎間盤及退變椎間盤時發現與未退化的椎間盤相比，退化椎間盤中髓核的GAG CEST值顯著降低(圖10)。而Trattnig等[10]利用GAG CEST研究膝關節軟骨成分,并將之與23Na MR進行比較，發現GAG CEST獲得的關節軟骨GAG分布圖與23Na MR獲得的GAG分布圖一致，且空間分辨率較好。

5.葡萄糖CEST成像(Gluco CEST)

葡萄糖被認為是一種潛在的可生物降解的MRI造影劑，可用于腫瘤的葡萄糖攝取成像。Xu等[6]率先通過注入葡萄糖，利用Gluco CEST 研究正常志愿者及腦膠質瘤患者。因為葡萄糖分子結構中含有羥基(-OH)，以其羥基中的氫質子作為可交換的質子，可以幫助實現對非標記的葡萄糖的攝取情況進行檢測。通過對4例正常志愿者和3例腦膠質瘤患者的動態葡萄糖增強圖像的觀察，證實Glucose CEST可用于研究人體葡萄糖攝取，提供動脈輸入功能、組織灌注、葡萄糖通過血腦屏障和細胞膜的轉運以及葡萄糖代謝的信息(圖11)。

6.谷氨酸 CEST 成像(Glu CEST)、肌酸CEST成像(Cr CEST)及肌醇CEST成像(MI CEST)

谷氨酸是中樞神經系統中常見的神經遞質，與信號處理功能有關，其含有較多的胺基(NH)，以其胺基中的氫質子作為可交換的質子，從而檢測其含量。肌酸是生物能量系統中的主要代謝產物，與細胞能量代謝相關，在細胞營養供給方面發揮著重要作用。肌酸中的胺基的氫質子可作為交換的質子，從而檢測肌酸含量。肌醇是神經膠質細胞增殖的標志物，以肌醇中的羥基的氫質子可作為交換的質子，從而檢測肌醇含量。

Cai等[7]通過GluCEST技術對谷氨酸進行成像，分別顯示了大鼠腦卒中模型、大鼠腦腫瘤模型及正常人腦的GluCEST圖譜，證實了采用GluCEST繪制谷氨酸濃度的可行性，以及其他腦代謝物對GluCEST效應的貢獻。Davis等[28]將GluCEST應用于無灶性癲癇患者中，發現癲癇側的海馬GluCEST的信號明顯增強，說明谷氨酸與癲癇的發生密切相關(圖12)。

Cai等[8]利用Cr CEST 技術對顱內膠質肉瘤和膠質瘤大鼠進行研究，發現CrCEST有助于區分不同侵襲性的膠質瘤。Kogan等利用Cr CEST 技術，在3T場強下觀察運動前后骨骼肌能量代謝的游離肌酸(Cr)的空間分布，證實Cr CEST具有良好的空間分辨率，能夠區分受試者肌肉運動前后的差異。

肌醇是神經膠質細胞增殖的標志物，在早期阿爾茨海默病(AD)的病理學中已被證實增加。利用內源性MICEST技術，可以定位腦內MI的濃度和膠質細胞增殖。Haris等[9]將MICEST技術應用于AD轉基因小鼠模型以及對照小鼠的腦中，發現AD小鼠的MI含量增高，與病理中膠質纖維酸性蛋白的免疫染色顯示出的膠質細胞增殖相一致，證實膠質細胞增殖在AD病理早期診斷中的潛在意義。

展望

CEST作為一種極具靈活性的分子成像技術，具有很大的臨床應用前景。CEST根據其飽和基團的不同，可測量的物質種類豐富；CEST也基于各種影響因素的影響，恰恰可以用于展現組織內微觀環境的改變，從而反映病理生理學的機制。隨著研究的深入，CEST將在臨床影像診斷及療效監控等應用領域進一步拓展，而且極有可能在分子及微觀機制研究水平方面發揮重要作用。