白雞冠茶樹CsPPH基因全長cDNA克隆與表達分析

周喆，陳志丹，吳全金，徐一嵐，孫威江1,*

白雞冠茶樹基因全長cDNA克隆與表達分析

周喆1,2,4，陳志丹2,3,4，吳全金5，徐一嵐3，孫威江1,2,3,4*

1. 福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2. 安溪縣現代農業產業協同創新中心，福建 泉州 362400；3. 福建農林大學安溪茶學院，福建 泉州 362400；4. 福建省茶葉工程技術研究中心，福建 福州 350002；5. 福建廣播電視大學財經與管理系，福建 福州 350002

脫鎂葉綠素酶（Pheophytinase，PPH）是葉綠素降解過程中的一個關鍵酶，它能使脫鎂葉綠素a轉化為脫鎂葉綠酸a，脫鎂葉綠酸a是葉綠素降解途徑中最后一個保持植物綠色的產物，被認為是葉片衰老和黃化的關鍵步驟。以新梢白化茶樹白雞冠葉片為材料，克隆獲得基因cDNA的全長序列（登錄號：MK359094），并對其進行生物信息學分析。結果表明，全長為1?298?bp，包含的ORF序列為1?241?bp，編碼413個氨基酸。序列分析表明，該基因編碼的蛋白質為穩定疏水蛋白，其預測分子量為45?741.50?Da，理論等電點為6.12。預測該基因主要定位于葉綠體中。qRT-PCR結果顯示，遮蔭抑制白雞冠葉片的表達，葉綠素升高，葉色變綠；光照促進白雞冠葉片的表達，葉綠素降解，導致葉片白化。

茶樹白化；基因；克隆；生物信息學分析

近年來，我國茶樹品種和茶葉品類呈“五顏六色”發展趨勢[1]。白雞冠是武夷山“四大名叢”之一，自發現并被利用至今已有三百余年的歷史[2]。王開榮等[3]研究提出，光照敏感型白化茶的白化—返綠共性取決于光照強度，隨光照強度增強白化明顯，而與溫度、土質、肥培條件基本無關。Wu等[4]研究表明，白雞冠茶樹屬于光照敏感型茶樹。目前，茶樹白化葉片產生的原因有很多，主要聚焦于葉綠素合成途徑和類胡蘿卜素途徑。前人研究認為，由于白化茶樹葉綠素合成少于常規綠葉品種，導致新梢白化[5-7]。類胡蘿卜素生物合成被抑制也會導致茶樹在強光或正常光照下產生光氧化損傷，從而對葉綠體發育造成影響[5,8]，形成白化表型。但也有研究報道指出，其可能是葉綠素的降解速率大于合成速率，導致葉色白化[9]。

脫鎂葉綠素酶（Pheophytinase，PPH）是葉綠素降解代謝中的關鍵酶。自2009年發現了基因后，葉綠素降解途徑的研究又進一步更新[10-11]。葉綠素降解主要有兩條途徑：一是葉綠素a被葉綠素酶（Chlorophyllase，CLH）脫去植醇（Phytol），形成脫植基葉綠素a（Chlorophyllide a），之后在脫鎂酶（SGR）的作用下脫去鎂離子，形成脫鎂葉綠酸a（Pheophorbide a），又在脫鎂葉綠素加氧酶（Pheophorbide a oxygenase，PAO）作用下形成紅色葉綠素代謝副產物（Red chlorophyll catabolite，RCC），然后被RCC還原酶（Red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）還原成初級熒光葉綠素分解代謝產物（Primary fluorescent chlorophyll catabolite，PFCC）；二是葉綠素a先被脫鎂酶脫去鎂離子，形成脫鎂葉綠素a（Pheophytin a）后被基因催化脫去植醇，形成脫鎂葉綠酸a，此后降解與第一條途徑一樣，最終降解成初級熒光葉綠素分解代謝產物（PFCC）[12-14]。基因位于葉綠素降解途徑2，能夠專一脫去植醇，形成脫鎂葉綠酸a。許多研究者克隆了不同植物中的基因，發現可能會促進植物衰老[15-17]。葉綠素的合成與降解是由多組酶參與的過程，其中任何一個編碼酶基因的突變都有可能使相關酶的活力發生改變，影響相關物質的合成，從而導致葉綠素降解過程受阻，使葉色表現出不同程度的變化[18]。在常規綠葉植物中，它的缺失會使植物呈現滯綠表現型，導致葉綠素降解過程減緩[15]。基因在水稻[19]、甘藍[20]、黃瓜[15,21]、小麥[22]、鳳梨[23]、芥藍[24]、花椰菜[25-26]等植物中相繼被克隆，但是前人對植物基因的研究多集中于其造成的植物衰老滯綠方面[15]，關于基因在白化茶樹中的作用機制，目前鮮有研究。

白雞冠與常規綠色茶樹品種相比，其關鍵化學成分和轉錄模式都有很大不同。研究其葉綠素代謝過程中的分子機制，有助于了解白化茶樹體內的代謝變化及遺傳變異，對研究茶樹光合作用機制、葉色調控機理、葉片發育調控等有重要理論價值[27]，同時也在茶樹生長發育、抗逆性、良種繁育等方面具有重要的應用價值[28-29]。因此本研究主要以白雞冠茶樹為研究對象，克隆了基因的cDNA全長序列，并對其進行了生物學信息分析和表達分析，初步研究不同遮蔭處理下基因的表達差異導致葉綠素降解差異對白雞冠茶樹葉片白化的影響，為深入研究白雞冠茶樹的白化機制提供分子方面的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為白雞冠茶樹葉片，取自武夷星茶業有限公司種質資源圃（北緯27°55′15″，東經118°02′50″）。2018年9月中旬，用鋁箔進行第二葉位葉片的遮蔭處理，遮蔭處理方法如表1所示。試驗記錄頻率為24?h一次，達到對應遮蔭天數時取下鋁箔，觀察白雞冠茶樹葉色的恢復情況。取樣時，遮蔭前、遮蔭復綠及復綠重新光照葉片作為一組。取生長發育狀況相近，形狀大小一致的第二葉位葉片，迅速用液氮冷凍處理，置–80℃冰箱保存，用于基因克隆和qRT-PCR檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片葉綠素含量的檢測

根據遮蔭處理組，使用SPAD502葉綠素含量測定儀（Konica Minolta）對白雞冠第二葉位葉片進行檢測，主脈兩側各隨機選取3個點進行測定，取平均值。采用Excel 2010和SPSS 22.0進行誤差檢驗和單因素方差分析（ANOVA）。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用天根的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取白雞冠第二葉的總RNA；用超微量分光光度計（賽默飛，Nano Drop 2000c）測定提取的總RNA濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所得的總RNA的完整性，于–80℃冰箱保存備用。

采用Promega goscriptTMreverse transcription system（A5000，PROMEGA，USA），按說明書步驟進行cDNA反轉錄，用于后續的RT-PCR和qRT-PCR試驗。

1.2.3基因的全長cDNA克隆

從NCBI搜索擬南芥的PPH蛋白序列并下載，將其在茶樹基因組數據庫中進行比對得到候選基因的蛋白序列，根據得到的蛋白序列編號檢索茶樹的cDNA序列并下載，最后篩選得到茶樹基因。利用DNAMAN設計引物（表2）。在其編碼區的兩端設計引物-F和-R，以白雞冠茶樹第二葉cDNA為模板，使用高保真酶TaKaRa Prime STAR GXL DNA Polymerase：R050A進行PCR擴增，擴增體系為：5×Prime STAR GXL Buffer 10?μL，dNTP Mixture 4?μL，上下游引物、cDNA模板、Prime STAR GXL DNA Polymerase各1?μL，用ddH2O補至50?μL。PCR擴增反應條件：94℃預變性3?min；98℃變性10?s，56℃退火15?s，68℃反應64?s，共34次循環；72℃延伸5?min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物條帶，驗證后切膠，使用Omega膠回收試劑盒（Gel extraction kit）進行膠回收。膠回收產物連接到pESI-Blunt simple vetor（30?g·μL-1）載體，轉入DH5α感受態細胞，培養16~18?h后挑取克隆搖菌，菌液經PCR驗證后挑選5個陽性克隆送至福州鉑尚測序公司測序。

1.2.4基因的生物學信息分析

通過NCBI的Blast功能進行氨基酸序列同源性比較；通過ProtParam在線網站（http://web.expasy.org/protparam）預測編碼蛋白的理化性質和蛋白質的一級結構；通過ProtScale（https://web.expasy.org/ protscale）對蛋白質親疏水性分析；通過TMHMM和TMpred（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM）進行蛋白質跨膜結構的預測；SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP）進行編碼氨基酸的信號肽預測；采用SMART軟件對編碼蛋白結構域進行預測，運用Scratch Protein Prodictor和Phyre2對蛋白質序列進行二、三級結構預測。通過NCBI-CDD分析保守結構域。通過TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）預測茶樹基因的亞細胞定位；運用MEGA 7.0軟件中的近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ）（500 Bootstrap Method）構建基因同源進化樹。

1.2.5基因的實時熒光定量PCR分析

表2 引物序列

2 結果與分析

2.1 CsPPH基因的cDNA全長克隆

經克隆得到基因的cDNA全長序列為1?298?bp。經開放閱讀框（ORF）軟件分析，基因含有1?241?bp的完整ORF，編碼413個氨基酸（圖1）。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果與預期相符（圖2）。

2.2 CsPPH基因的生物學信息分析

利用在線軟件ProtParam對基因進行蛋白質基本理化性質預測與分析，預測該蛋白相對分子質量為45?741.50?Da，編碼413個氨基酸，理論等電點為6.12，包含6?481個原子，分子式為C2080H3247N555O591S8。其中，該蛋白氨基酸組成成分中亮氨酸（Leu）含量最高，占比14.0%；除了吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）占比為0以外，半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）占比最低，為1.0%。其半衰期在哺乳動物體外網織紅細胞內為30?h，在酵母細胞內大于20?h，在大腸桿菌內大于10?h。CsPPH的消光系數為60?640，不穩定系數為41.72，為穩定蛋白，其脂肪系數為108.57。通過Prot Scale軟件預測分析，CsPPH氨基酸殘基在當前整個區域中所表現的疏水性要大于親水性，而且大部分都處在正值的較高位置，該蛋白總平均親水性為0.036，故CsPPH蛋白是偏向疏水性的，為疏水性蛋白（圖3）。

TMHMM server 2.0預測顯示該蛋白不存在跨膜結構（圖4）。TargetP亞細胞定位預測結果表明該基因定位于葉綠體。SignalP 4.1 Server預測該蛋白序列無信號肽，屬于非分泌性蛋白。NetPhos 3.1 Server對蛋白進行磷酸化位點分析預測（圖5），結果表明，多肽鏈上共有41個磷酸化位點，分別為27個絲氨酸（Ser）位點，11個蘇氨酸（Thr）位點和3個酪氨酸（Tyr）位點。磷酸化位點占全序列的9.9%，主要能夠被cdc2蛋白（cdc2）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）和酪蛋白激酶I（CKI）等蛋白激酶磷酸化。FoldIndex軟件可折疊性結果預測有序氨基酸殘基數量占序列總比例的76.7%，判斷其為有序蛋白。采用SCRATCH Protein Prodictor預測CsPPH二級結構，結果顯示：α-螺旋占76.88%，β-折疊占0.08%，無規則卷曲占23.04%。使用Phyre2對該蛋白三級結構進行預測（圖6），該模型基于可溶性環氧化物水解酶的晶體結構（c3i28A）進行建模，二者相似度高達66%，其預測結果具有較高的可信度。通過NCBI-CDS在線分析基因的保守結構域（圖7），發現其編碼的氨基酸序列中含有PLN02679結構域，屬于PLN02679超級家族。

2.3 CsPPH基因進化樹構建

將該蛋白的氨基酸序列進行BLASTp比對，結果顯示，其與多個物種的PPH蛋白序列均有較高的相似性，相似率在70%以上。利用MEGA 7.0對選取的20條相似度較高的序列進行進化樹分析，結果顯示（圖8），茶樹聚在A類，與蓮（）的關系最近，與蓮、博落回（）、葡萄（）、芝麻（）的PPH蛋白相似性分別達到88%、80%、79%和77%。利用Jalview軟件對CsPPH蛋白與其他植物PPH蛋白進行氨基酸序列比對，結果顯示（圖9），該蛋白在各種植物中具有高度保守性。

注：黃色陰影部分為起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，灰色陰影部分表示PLNO2679保守結構域，黑色下劃線為編碼區

注：M：DNA分子標準量，1：CsPPH基因PCR產物

圖3 CsPPH氨基酸序列親/疏水性分析

圖4 CsPPH蛋白的跨膜螺旋區

圖5 CsPPH磷酸化位點預測

2.4 不同遮蔭處理下白雞冠茶樹葉綠素含量的變化

由表3和圖10可得知，遮蔭處理后，白雞冠茶樹葉片的葉綠素含量均高于不遮蔭白化葉片。隨著遮蔭天數的增加，白雞冠葉片的葉綠素含量極顯著上升，第6天含量最高，達到26.98。不遮蔭處理的葉片變化不顯著，恢復光照的葉片葉綠素含量顯著下降，第6天低至14.30。試驗表明，遮蔭顯著影響白雞冠新梢白化葉片的葉綠素含量。

圖6 CsPPH蛋白質三級結構

圖7 CsPPH蛋白功能性位點分析

圖8 CsPPH氨基酸序列進化樹分析

注：方框表示超家族的保守結構域PLN02679；A：美花煙草（XP 009792199.1）；B：煙草（XP 019264379.1）；C：芝麻（XP 011096167.1）；D：茶樹(MK359094)；E：蓮（XP 010252240.1）；F：博落回（OVA05823.1）；G：川桑（XP 010112231.1）；H：土瓶草（GAV71596.1）；I：大桉（XP 010063750.1）

2.5 茶樹CsPPH基因在不同遮蔭處理下的表達模式分析

采用實時熒光定量PCR技術，分析白雞冠茶樹基因在不同遮蔭處理下的相對表達量差異。由圖11所示，基因在進行遮蔭處理后的相對表達量下調，在遮蔭第2天達到最低水平。在不遮蔭處理中，相對表達量在第1天和第2天上調，且在第1天達到最高水平，在第3天至第6天處于下調。在恢復光照處理的白雞冠中，相對表達量始終上調，第1天表達量最高。通過SPSS 22.0軟件進行相關性和單因素方差分析得到，在不同處理后白雞冠葉片中基因的相對表達量與葉綠素含量呈極顯著負相關（=–0.647；=0.007<0.01）。

表3 不同處理下的白雞冠SPAD值

注：不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著，小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

Note: Different majuscule indicate significant difference at 0.01 level, different minuscule indicate significant difference at 0.05 level

圖10 不同處理下白雞冠茶樹二葉SPAD值

注：與不遮蔭和恢復光照葉片相比，*：差異顯著（P<0.05）

3 討論

植物葉色白化突變產生機制非常復雜，涉及到很多調控途徑和代謝過程，以及內外部環境的共同作用等[26]。光敏型白化茶樹白雞冠作為特殊的茶樹種質資源，其轉錄模式與常規綠葉品種有很大不同，白化葉色研究有助于葉綠素代謝、葉綠體發育及光合系統的研究，同時也是分子育種的典型材料[25]。白雞冠茶樹對光強較為敏感，葉綠體發育不全，葉綠素含量較其他綠葉品種少。

本研究從茶樹中成功克隆到1個基因，該基因開放閱讀框為1?241?bp，編碼413個氨基酸，并且含有PPH酶特征序列和α/β水解酶折疊。該蛋白為疏水性蛋白質，無跨膜螺旋區，預測亞細胞定位于葉綠體。在對其他植物基因的研究中發現，所有的PPH蛋白質都存在α/β水解酶折疊，其主要氨基酸序列顯示的很多區域在成員之間有高度的保守性，且PPH酶催化反應時都位于葉綠體內[21]。

葉綠素的積累在植物體內以動態的形式存在[30-31]，是一個合成與分解的綜合過程。自然強光條件下，白雞冠茶樹隨著光照時間的增加，葉片SPAD值基本沒有變化，而遮蔭處理的葉片SPAD值線性上升，表現為正常光照的葉色變白，而遮蔭處理的葉片明顯轉綠。表明正常光照條件下白雞冠茶樹白化葉片葉綠素含量維持在一個較低的水平，而遮蔭處理使得葉片的葉綠素含量上升，葉片呈現綠色。這與Fan等[32]的研究相符，他們通過代謝組和蛋白質組研究，闡釋了光強對黃金芽光合色素代謝及光合系統的影響，發現黃化葉色的產生是由于光照條件下，黃金芽的葉綠素合成降低，而降解增多，導致葉片黃化。白雞冠茶樹白化葉片遮蔭后，體內防御酶活性上升，清除由過剩光能產生的活性氧的能力增強，使之從光氧化損傷狀態恢復，重組和修復葉綠體類囊體膜結構，使葉綠素能夠正常合成。強光脅迫下，白化葉片防御酶活性低，不能清除由過剩光能產生的活性氧，造成膜損傷，導致類囊體膜結構降解，附著于其上的葉綠素降解，產生白化表型。這與低溫敏感型白化茶樹“安吉白茶”相似[33]。

基因是葉綠素降解機制的一個重要組成部分。在進行不同遮蔭處理后，白雞冠第二葉基因的表達顯著下降，結合SPAD檢測結果，表明是脫鎂葉綠素a向脫鎂葉綠酸a的降解過程受阻，使得葉片中脫鎂葉綠素a累積，葉綠素降解過程受阻，導致葉綠素累積，葉片復綠。這與李旭敏[34]的研究相符，黃金芽葉綠素合成途徑相關酶基因的抑制性表達，以及降解途徑相關酶基因的高表達是引起其總葉綠素含量低的主要原因。植物葉片衰老也與葉綠素降解有關。黃瓜[21]、大豆[35]等葉片衰老時，其葉綠素降解，含量減少，基因表達量顯著增加，葉色轉黃。在本研究中，遮蔭葉片在恢復光照后葉綠素的含量開始下降，相對表達量上調，說明光照對白雞冠的表達有顯著的調控作用。

本文結合葉綠素含量、基因克隆和相對表達量的研究結果，初步闡釋了葉綠素降解對白雞冠的白化機制起到關鍵作用。今后可以從分子角度深入把控白化機制，分離并研究具有潛在應用價值的基因，對白化突變體的遺傳改良具有十分重要的意義[15]。但是葉綠素降解酶的特性及分子生物學的研究還很少，其在降解過程中去植基的過程相當復雜，亟需進一步挖掘。

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Cloning and Expression Analysis ofGene in Tea Plant ()

ZHOU Zhe1,2,4, CHEN Zhidan2,3,4, WU Quanjin5, XU Yilan3, SUN Weijiang1,2,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Collaborative Innovation Center of Modern Agriculture Industrial Park of Anxi County, Quanzhou 362400, China; 3. College of Tea, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 4. Engineering Technology and Research Center of Fujian Tea Industry, Fuzhou 350002, China; 5. Department of Finance and Management, The Open University of Fujian, Fuzhou 350002, China

Pheophytinase (PPH) is a key enzyme in chlorophyll degradation. It can convert pheophytin a into pheophorbide a, which is the last product to keep green in chlorophyll degradation pathway. This step is considered to be a key step of leaf senescence and yellowing. In this study, the full-length sequence ofgene was cloned from the new shoot leaves of albino tea plantcv. Baijiguan (MK359094), and its biological characteristics were analyzed. The full-length ofwas 1?298?bp, and the ORF was 1?241?bp, encoding 413 amino acids. Sequence analysis indicated that the encoded protein was a stable hydrophobic protein, and its molecular weight was predicted to be 45?741.50?Da. Its theoretical isoelectric point was 6.12. It was mainly located in chloroplasts. The real-time fluorescence quantitative PCR showed that under shading conditions, the expression ofwas inhibited, chlorophyll increased and leaf color turned green. Light promoted the expression ofin leaves of cv.Baijiguan, and chlorophyll degradation led to leaf albinism.

albinism of tea plant,gene, clone, bioinformatics analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)01-039-12

2019-06-10

2019-09-02

國家自然科學基金項目（31770732）、農業農村部資助項目——福建省安溪縣現代農業產業園建設（KMD18003A）、2017年福建省科技計劃項目（2017N3012）

周喆，女，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種與分子生物學方面的研究，742382124@qq.com。

swj8103@126.com