豬偽狂犬病毒流行株的分離鑒定及其毒力試驗(yàn)

駱輝，王雪濤，廖果，謝偉，羅旭，陰文奇，周遠(yuǎn)成*

（1.畜科生物工程有限公司，畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610200；2.四川省樂(lè)山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 樂(lè)山 614000）

豬偽狂犬病（PR）是由偽狂犬病毒（PRV）所引起的豬、牛、羊等多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。豬是該病的天然宿主、主要儲(chǔ)存宿主和傳染源，無(wú)論是新生仔豬、育肥豬，還是成年種豬均可感染PRV，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。2 周齡內(nèi)仔豬感染PRV 后死亡率較高，有的可達(dá)100%，常伴有腹瀉、嘔吐及共濟(jì)失調(diào)、角弓反張等神經(jīng)癥狀；斷奶仔豬也能引起死亡，但主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀，也有部分豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉、嘔吐等，耐過(guò)的仔豬往往發(fā)育不良，成為僵豬；育肥豬感染后可出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難，主要以呼吸道癥狀為主，死亡率較低；成年豬感染后不發(fā)病或僅表現(xiàn)為體溫升高等輕微癥狀，呈隱性感染，長(zhǎng)期帶毒或排毒，成為最危險(xiǎn)的傳染源；妊娠母豬感染后會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等；種豬感染可致不育、睪丸腫脹，母豬返情、屢配不孕等[3-4]。

2011 年以來(lái)，我國(guó)多個(gè)省份出現(xiàn)免疫PRV疫苗的豬場(chǎng)發(fā)生豬偽狂犬病的案例，發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失，引起了業(yè)內(nèi)高度重視[5]。本試驗(yàn)分別從國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)采集了11份疑似豬偽狂犬病的病料，開(kāi)展PRV流行毒株的分離與鑒定，并對(duì)不同地區(qū)分離的流行毒株進(jìn)行基因同源性分析和毒力試驗(yàn)，為豬偽狂犬病的防控提供新的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 病料來(lái)源 2015～2018 年，從四川南充、遂寧等地共采集豬偽狂犬病毒疑似陽(yáng)性病料6 份，從湖北不同養(yǎng)殖場(chǎng)共采集豬偽狂犬病毒疑似陽(yáng)性病料2 份，從江西不同養(yǎng)殖場(chǎng)共采集豬偽狂犬病毒疑似陽(yáng)性病料3份，共計(jì)11份。所有疑似陽(yáng)性病料都保存于畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞與試劑 PK-15細(xì)胞，由畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；新生牛血清、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自GIBCO 公司；TAKARA MiniBest Viral RNA∕DNA Extraction Kit試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；豬偽狂犬病毒gB、gE ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；PCR檢測(cè)相關(guān)試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 8～9 周齡豬偽狂犬病毒gB、gE ELISA 抗體呈陰性的健康試驗(yàn)豬，購(gòu)自成都某豬場(chǎng)。

2 方法

2.1 病料處理 將采集的病料組織加液氮研磨后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液按1∶5混合制成組織懸液，放置-70℃以下冰箱中凍融1次，以12000r∕min離心10 min，取上清液使用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，再次以12 000 r∕min 離心30 min，取上清液進(jìn)行病毒分離。取0.5 mL 處理好的組織液接種致密單層的PK-15傳代細(xì)胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1h，倒掉病毒液，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液；再次置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。連續(xù)觀察5日，若未出現(xiàn)CPE，則取細(xì)胞培養(yǎng)液再次接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的PK-15 細(xì)胞進(jìn)行盲傳，直至出現(xiàn)CPE。當(dāng)CPE 達(dá)75%以上時(shí)，取培養(yǎng)液上清繼續(xù)接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的PK-15 細(xì)胞進(jìn)行病毒傳代。當(dāng)接種病毒的細(xì)胞出現(xiàn)CPE 后，連續(xù)傳代5 次，所有收獲的病毒液于-80 ℃保存。

2.2 外源病毒檢驗(yàn) 取出現(xiàn)CPE 以后代次的病毒液，按TAKARA MiniBest Viral RNA∕DNA Extraction Kit 試劑盒的方法提取核酸，分別以本實(shí)驗(yàn)室建立的豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細(xì)小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、支原體的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

2.3 病毒含量測(cè)定 將分離的PRV 流行毒株，用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-6、10-74 個(gè)稀釋度，分別接種于已長(zhǎng)成良好單層、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔PK-15細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種6 孔，每孔0.1 mL，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h 后，每孔補(bǔ)加含4%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液0.1 mL。再次置37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5日，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2.4 病毒中和試驗(yàn)鑒定 將分離的豬偽狂犬病毒流行毒株，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液分別稀釋成103TCID50∕mL的病毒懸液，與56 ℃滅活30 min的豬偽狂病毒特異性血清等量混合，置37 ℃作用1 h；接種于已長(zhǎng)滿(mǎn)單層PK-15細(xì)胞并棄去細(xì)胞培養(yǎng)液的12 孔培養(yǎng)板，每孔0.2 mL，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照（每組2 孔）。置37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h 后，每孔補(bǔ)加含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液3 mL，再次置37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5日，記錄各孔CPE情況。

2.5 不同流行毒株主要基因序列分析 根據(jù)PRV 基因組特征設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增gB、gC、gD、gE 基因序列全部或部分片段，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定（表1），使用DNAstar 和MEGA 7.0 分析軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的差異比較，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2.6 毒力試驗(yàn) 將鑒定合格的豬偽狂犬病毒流行毒株，每個(gè)毒株選用1 個(gè)代次進(jìn)行毒力試驗(yàn)。將待檢病毒稀釋成106.0TCID50∕mL，每個(gè)分離株接種8～9 周齡PRV gB、gE 抗體呈陰性的健康仔豬5 頭，每頭滴鼻接種3 mL。接種前觀察2～3 日，每日定時(shí)測(cè)體溫1 次，取其平均值作為基礎(chǔ)體溫。接種后連續(xù)觀察21日，每日定時(shí)測(cè)量體溫1次，觀察試驗(yàn)豬精神、食欲是否正常，是否出現(xiàn)呼吸困難、神經(jīng)癥狀等偽狂犬病相關(guān)臨床癥狀，同時(shí)記錄試驗(yàn)豬死亡情況。

表1 PRV主要結(jié)構(gòu)蛋白擴(kuò)增引物序列信息

3 結(jié)果

3.1 病毒分離結(jié)果 從11份豬偽狂犬病疑似陽(yáng)性病料中共分離到6 株病毒，其中從四川采集的6 份病料中分離到3 株病毒，分別命名為SCHS株、SCM1 株、SCY1 株；從湖北采集的2 份病料中分離到1株病毒，命名為HBA1株；從江西采集的3 份病料中分離到2 株病毒，命名為JXHS 株與JXN1株。

3.2 外源病毒檢測(cè)結(jié)果 從四川分離的3 株病毒中，SCHS 株與SCM1 株僅PRV 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其余檢測(cè)結(jié)果均為陰性，SCY1株的PRV與支原體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。從湖北分離的HBA1株的PRV、PCV2 與支原體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。從江西分離的JXHS 株僅PRV 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，JXN1 株的PRV 和PCV2 檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。病毒純凈性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 豬偽狂犬病毒分離株的PCR檢測(cè)結(jié)果

3.3 病毒含量測(cè)定結(jié)果（表3） SCHS株與JXHS株在PK-15 細(xì)胞上適應(yīng)良好，F(xiàn)5～F10 代的最高病毒含量分別為107.4TCID50∕mL、107.75TCID50∕mL；SCM1 株、SCY1 株、HBA1 株、JXN1 株F5～F10 代的最高病毒含量在106.4TCID50∕mL左右。

3.4 中和試驗(yàn)鑒定結(jié)果 用純凈性檢驗(yàn)僅PRV呈陽(yáng)性的SCHS株、SCM1株、JXHS 株進(jìn)行中和試驗(yàn)鑒定，結(jié)果顯示3 株分離病毒均能被豬偽狂犬病毒特異性血清中和。

表3 豬偽狂犬病毒分離株的病毒含量測(cè)定結(jié)果

3.5 不同毒株主要基因序列分析 使用所設(shè)計(jì)的引物成功擴(kuò)增出6個(gè)分離毒株的部分gB、gC基因和全長(zhǎng)gD、gE 基因，對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，獲得了6 個(gè)毒株的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因序列。通過(guò)DNAstar 軟件分析，發(fā)現(xiàn)所分離毒株HBA1、JXN1、SCY1 的gB 擴(kuò)增片段核苷酸序列與JS-2012株的同源性為100%，其余毒株的gB擴(kuò)增片段核苷酸序列與JS-2012株的同源性為99.7%～99.9%，與Bartha 株的同源性在95.4%～95.6%之間。JXHS、SCHS、JXN1 的gC 基因與JS-2012 株的同源性為100%，其余毒株的gC基因與JS-2012株的同源性為99.5%～99.8%；所有分離毒株的gC 基因與Bartha 株的同源性均在90.7%～91.2%之間。SCY1 株、SCM1 株、JXHS 株的gD 基因與JS-2012 株的同源性為100%，其余毒株的gD 基因與JS-2012株的同源性為99.8%或99.9%；所有分離毒株的gD基因與Bartha株的同源性在98.7%～98.9%之間。所有分離毒株的gE 基因與JS-2012株的核苷酸同源性在99.1%～99.8%之間。

選擇近年來(lái)我國(guó)流行的PRV 流行毒株和PRV 經(jīng)典毒株的相應(yīng)序列，構(gòu)建gB、gC、gD 和gE基因序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示4 個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白基因序列的分析結(jié)果一致，PRV 呈現(xiàn)2 個(gè)不同基因型分支，即：以Bartha株為代表的基因1型和我國(guó)分離株形成的基因2型。本試驗(yàn)分離的毒株均為基因2 型毒株，與當(dāng)前我國(guó)主要流行毒株的遺傳關(guān)系接近。

3.6 不同毒株的毒力試驗(yàn)結(jié)果 用純凈性檢驗(yàn)僅PRV呈陽(yáng)性的SCHS株、SCM1株、JXHS株進(jìn)行毒力試驗(yàn)，結(jié)果顯示3 個(gè)流行毒株均能導(dǎo)致8～9周齡試驗(yàn)豬100%（5∕5）發(fā)病。用SCHS 株攻毒后全部試驗(yàn)豬（5∕5）都出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內(nèi)有3∕5 死亡；用SCM1 株攻毒后有4∕5 的試驗(yàn)豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內(nèi)有1∕5 死亡；用JXHS 株攻毒后有2∕5 的試驗(yàn)豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內(nèi)全部存活。不同毒株的毒力試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 豬偽狂犬病毒不同分離株的毒力試驗(yàn)

4 結(jié)論與討論

2011 年前后在全國(guó)范圍內(nèi)出現(xiàn)了新的豬偽狂犬病疫情，主要表現(xiàn)為突發(fā)性大面積種豬流產(chǎn)，育肥豬致死性感染，豬群gE 抗體陽(yáng)性率突然升高，部分豬場(chǎng)的gE 抗體陽(yáng)性率高達(dá)100%。疫情發(fā)生的地區(qū)不同、免疫狀況不同而呈現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)。免疫狀況較好的豬場(chǎng)，大多無(wú)明顯臨床癥狀，但豬群gE 陽(yáng)性率突然升高；免疫狀況較差的豬場(chǎng)，主要表現(xiàn)為種豬大面積流產(chǎn)、仔豬腹瀉、育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀與急性死亡[6]。

新疫情發(fā)生以后，全國(guó)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室分離到新的豬偽狂犬病毒流行毒株，經(jīng)過(guò)致病力試驗(yàn)、免疫保護(hù)試驗(yàn)和分子流行病學(xué)研究，一致認(rèn)為新流行的豬偽狂犬病毒株在主要毒力基因gE、gI以及與免疫保護(hù)相關(guān)的基因gB、gC、gD上存在多個(gè)位點(diǎn)的變異[7-9]。從我國(guó)不同地區(qū)分離的新流行毒株，與目前廣泛使用的豬偽狂犬病活疫苗Bartha K61 毒株位于不同的基因亞型，動(dòng)物試驗(yàn)與中和抗體檢測(cè)均證實(shí)Bartha K61 毒株對(duì)我國(guó)豬偽狂犬病免疫保護(hù)的效果較差，其保護(hù)力低于50%，而使用流行毒株構(gòu)建的基因缺失疫苗能夠?yàn)樽胸i提供100%的免疫保護(hù)[10-12]。本試驗(yàn)分離的6株豬偽狂犬病毒主要基因位點(diǎn)與國(guó)內(nèi)豬偽狂犬病毒流行毒株JS-2012 株的同源性均在99%以上；與Bartha K61 株gB 基因的同源性約為95%，與gC 基因的同源性在90.7%～91.2%，與gD 基因的同源性在98.7%～98.9%。基于主要基因位點(diǎn)的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，豬偽狂犬病毒已呈現(xiàn)2個(gè)不同的基因型分支，即：以Bartha株為代表的基因1型和我國(guó)流行的基因2型。本試驗(yàn)分離的毒株均為基因2 型毒株，與當(dāng)前我國(guó)主要流行毒株的遺傳關(guān)系接近。

豬偽狂犬病毒只有一個(gè)血清型，但不同毒株在毒力和生物學(xué)特征等方面存在差異。本試驗(yàn)分離的豬偽狂犬病毒SCHS 株、SCM1 株與JXHS株無(wú)外源病毒污染，滴鼻感染8～9 周齡試驗(yàn)仔豬，均能導(dǎo)致試驗(yàn)豬全部（5∕5）出現(xiàn)體溫反應(yīng)，但不同毒株的毒力存在較大差異。SCHS株攻毒后全部（5∕5）出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內(nèi)有3∕5死亡；SCM1株攻毒后有4∕5出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內(nèi)有1∕5 死亡；JXHS 株攻毒后有2∕5 出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內(nèi)全部存活。

SCHS、SCM1、JXHS 這3 個(gè)純凈的豬偽狂犬病毒流行毒株均能導(dǎo)致易感動(dòng)物發(fā)病，成功地構(gòu)建了豬偽狂犬病流行毒株的攻毒模型。本試驗(yàn)有助于進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同毒株活疫苗對(duì)我國(guó)當(dāng)前PRV流行毒株的攻毒保護(hù)效果，為豬偽狂犬病疫苗的評(píng)價(jià)，滅活疫苗及新型弱毒疫苗的研發(fā)提供新的依據(jù)。