烏司他丁對農藥中毒大鼠腦組織保護作用的研究

王 嘯，明 丹，王維展，王 璞，李 娜，何佳起

隨著農藥的普及，近年來農藥中毒的事件逐年遞增[1]。現階段常見的農藥包括礦物源農藥、生物源農藥和化學合成農藥(敵敵畏、百草枯等)[2]。敵敵畏是一種較為常見的有機磷農藥，這類農藥可抑制乙酰膽堿酯酶，造成延遲周圍神經病變[3]。百草枯中毒后會直接作用于中毒者的器官，造成肺、心、肝、腎功能衰竭導致患者死亡[4]。烏司他丁(utinastatin， UTI)是抗炎藥物之一，其作用機制是通過下調促炎因子和上調抗炎因子，同時調控或阻斷機體炎癥反應過程實現對炎癥的抑制[5]。UTI是一種高效的酶抑制劑，可抑制多種蛋白酶，具有防御組織破壞的作用。目前已有研究證實UTI可減輕急性百草枯和敵敵畏中毒，但對于UTI對農藥中毒大鼠腦組織保護作用機制的報道較少。本文旨在研究UTI對農藥中毒大鼠腦組織保護作用，以期了解其作用機制，從而為農藥中毒提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：SPF級3周齡SD大鼠60只，體重200～220 g(廣東醫學院實驗動物中心，實驗動物許可證號：粵監證字 2004A029號)。飼養于本院動物中心實驗室，分12籠飼養，每籠5只。飼養溫度20～25℃，相對濕度50%～65%。該實驗經動物倫理委員會批準同意。

1.1.2藥物與試劑：農藥(草銨膦)購自四季豐園有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde ,MDA)試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)試劑盒購自上海索橋生物有限公司；NMDA受體試劑盒購自江萊生物；超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司；PTEN誘導激酶1(PTEN-inducible kinase 1, Pink1)抗體購自艾美捷科技有限公司；過氧化物還原酶6(peroxide reductase 6, Prdx6)抗體購自上海龍田生物技術有限公司；中性福爾馬林、乙醇、二甲苯均購自天津科密歐有限公司。

1.1.3實驗儀器：BS-124s 型電子天平(北京賽多斯儀器系統有限公司)；TDL-5 型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；光學顯微鏡(東莞市同創儀器有限公司)；低溫離心機(湖南恒諾離心機有限公司)；蛋白電泳及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(以色列DNR公司)；BS-124s 型電子天平(北京賽多斯儀器系統有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及建立模型：60只SD大鼠適應性喂養 1 周后，隨機分為對照組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組15只。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 ml，其余3組大鼠均給予腹腔注射農藥2 ml造模，造模后立即觀察大鼠一般狀態及癥狀并記錄。

1.2.2藥物干預：建立模型后2 h，低劑量組腹腔內注射UTI 75 kU/kg，高劑量組腹腔內注射UTI 150 kU/kg，對照組和模型組分別腹腔內注射和高劑量組等量的生理鹽水。

1.3觀察指標及方法

1.3.1大鼠一般情況觀察：建立模型并使用藥物干預完成后立即觀察大鼠一般狀態及癥狀并記錄。當大鼠出現全身顫動、口腔分泌物增多、步態不穩中的任意一項即判定為中毒。大鼠肌顫強度分為4級，具體分級方式參考戴旭鋒等[6]研究。

1.3.2血清中氧化應激物質及炎性因子檢測：建立模型并使用藥物干預完成后24 h，使用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，腹主動脈取血分離血清，保存在-20℃條件下待測，按照試劑盒說明書檢測MDA、GSH-Px、TNF-α、IL-6含量。

1.3.3腦組織及全血AChE活力及NMDA受體活性檢測：建立模型并使用藥物干預完成后24 h，處死大鼠，取大鼠腦組織使用冰生理鹽水沖洗，按照1∶9制成10%的組織勻漿，使用恒溫離心機，在4℃、3500 r/min離心的條件下離心10 min，去上清液，在-20℃凍存待測，測定大鼠全血和腦組織的AChE活力及NMDA受體的活性，使用Scatchard作圖并求出NMDA受體的最大結合容量(Bmax)和平衡解離常數(Kd)。

1.3.4Western blot 檢測蛋白表達水平：取各組大鼠海馬區腦組織并用剪刀剪取小塊，使用胰蛋白酶處理，提取組織總蛋白，使用半干法將蛋白轉移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以β-actin為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1大鼠血清中炎性因子水平 與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α及IL-6水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，高劑量組和低劑量組大鼠血清中TNF-α及IL-6含量水平顯著降低，且高劑量組低于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 4組大鼠血清中炎性因子水平比較

低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；UTI為烏司他丁，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白介素-6；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

2.2大鼠血清中MDA、GSH-Px水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中MDA含量水平顯著升高，GSH-Px含量水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，高劑量組和低劑量組大鼠MDA含量水平顯著降低，GSH-Px水平顯著升高，且高劑量組上述指標變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 4組大鼠血清中MDA、GSH-Px水平比較

低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；UTI為烏司他丁，MDA為丙二醛，GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

2.3大鼠腦組織、全血AChE活力及腦組織NMDA受體活性比較 與對照組比較，模型組大鼠全血AChE活力、腦組織AChE活力、NMDA受體Bmax值顯著降低，NMDA受體Kd值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，低劑量組和高劑量組大鼠全血AChE活力、腦組織AChE活力、NMDA受體Bmax值顯著升高，且高劑量組上述指標變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 4組大鼠腦組織及全血AChE活力及腦組織NMDA受體活性比較

低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；AChE為乙酰膽堿酯酶，Bmax為最大結合容量，Kd為平衡解離常數，UTI為烏司他丁；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

2.4大鼠腦海馬區SOD1、Pink1及Prdx6表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬區SOD1、Pink1及Prdx6蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，UTI低劑量組和高劑量組大鼠海馬區SOD1、Pink1及Prdx6蛋白表達顯著升高，且高劑量組高于低劑量組(P<0.01)。見圖4。

3 討論

有機磷農藥中毒患者的死亡原因包括膽堿酯酶活性降低和炎癥反應。炎性因子包括促炎性因子和抗炎癥因子，促炎性因子水平升高，體內炎性因子水平降低，表明體內炎癥反應加劇；抗炎性因子升高，體內炎性因子受到抑制，則炎癥反應減弱[7-8]。目前研究較多的促炎性細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[9]；抗炎性細胞因子則包括IL-4、IL-10、IL-1等[10]。本研究主要探究了IL-6和TNF-α兩種炎性因子，發現UTI低劑量組和高劑量組大鼠血清中TNF-α及IL-6含量水平顯著降低，且高劑量組降低更顯著，說明UTI可顯著降低大鼠農藥中毒后體內炎癥反應，且隨著劑量增加效果更顯著。這可能是因為UTI可抑制水解蛋白酶，下調組織細胞的損傷實現降低TNF-α水平；同時UTI可以抑制中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放，實現抑制 TNF-α及IL-6的釋放，達到降低炎癥反應的效果。與周慧[11]的報道一致。

圖4 4組大鼠腦海馬區SOD1、Pink1、Prdx6蛋白表達水平比較

A.SOD1、Pink1、Prdx6蛋白免疫印跡檢測結果；B.SOD1、Pink1、Prdx6蛋白表達水平比較；低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；SOD1為超氧化物歧化酶1，Pink1為PTEN誘導激酶1，Prdx6為過氧化物還原酶6，UTI為烏司他丁；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

研究證實氧自由基的含量在有機磷農藥中毒患者的死亡中作用關鍵。雷間紅[12]研究表明，農藥中毒者體內過氧化反應顯著增強。MDA 會引發脂質過氧化反應，產生的系列降解產物可引起細胞代謝及功能障礙，同時MDA的含量可以反映機體受自由基攻擊后脂質過氧化及細胞損傷的程度[13]。細胞內氧化程度越高，MDA含量越高。GSH-Px是一種抗氧化保護酶，抗氧化保護酶可清除 H2O2，緩解氧自由基對組織細胞的損傷。當GSH-Px含量水平過低時，清除H2O2能力減弱，體內氧化反應加重。賈書花等[14]報道，SOD、GSH-Px 兩者共同作用能有效地阻止組織細胞過氧化的損傷。SOD1是經典的抗氧化酶之一，可有效清除活性氧[12]。機體內SOD1水平越高說明機體清除活性氧的能力越強，當腦組織損傷時期含量會顯著降低。Pink1也是抗氧化蛋白，Pink1丟失與神經元的易損性增加有關[13]。中毒后Pink1水平降低，表明大鼠腦組織中神經元受到損傷，且受損程度與Pink1水平呈負相關。Prdx6是一種獨特的抗氧化酶，具有過氧化物酶和磷脂酶活性，當大鼠有機磷農藥中毒后，其活性會受到顯著的抑制[14]。

本研究結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠體內MDA水平顯著升高、GSH-Px水平顯著降低，表明大鼠體內氧化反應顯著加重。UTI低劑量組和高劑量組大鼠MDA水平顯著降低、GSH-Px水平顯著升高，且高劑量組上述指標優于低劑量組。說明UTI顯著抑制了大鼠體內的氧化應激反應，且隨著使用劑量的增加，效果更為顯著。謝勇[15]報道，使用UTI可以降低患者體內氧化反應及炎癥反應，緩解中毒癥狀，與本研究得出的結論相一致。本研究中發現使用UTI的各組大鼠海馬區SOD1、Pink1及Prdx6蛋白表達顯著升高，說明大鼠神經元受到了保護，腦組織神經元得到了顯著的保護，與李艷華[16]研究結論一致。

目前AChE活力及腦組織NMDA受體活性也是評價農藥中毒程度的重要指標。劉佩強等[17]研究表明NMDA受體與調節呼吸功能的有關，當AChE活力下降會抑制呼吸功能導致患者死亡。本研究發現，使用UTI治療后大鼠體內的AChE活力顯著升高，說明大鼠的呼吸抑制程度得到了顯著的緩解。大鼠腦組織NMDA受體的活性有兩個重要指標，Bmax和Kd，其中Bmax下降，Kd值上升意味著腦組織NMDA受體密度的減少和親和力的下降。使用UTI低劑量和高劑量組大鼠Bmax下降和Kd值上升受到了抑制，說明UTI可增加NMDA受體密度，同時升高NMDA受體的親和力，從而實現保護中毒后大鼠的腦組織。與張虎等[18]報道的UTI可保護中毒后大腦組織結論相一致。

綜上所述，大鼠農藥中毒后UTI 可保護其腦組織，且在一定濃度范圍內呈濃度依賴性，作用機制可能與抑制腦組織和全身炎癥反應及氧化反應相關。目前農藥種類較多，本實驗使用的農藥相對單一，在后續實驗中將使用不同種類的農藥，進一步探討UTI對不同農藥中毒中保護大鼠腦組織效果。