桃腐爛病病原菌的分離鑒定

屈興武 周東有 徐清月

摘 要：目的：尋找引起屈家嶺地區桃樹果實腐爛病的致病微生物種類。方法：分別采用細菌培養通用培養基和PDA培養基，對采集自果林的腐爛的桃果實等樣本進行微生物純化，對各種微生物分離物進行形態觀測，結合16rDNA序列分析和致病性測定，對致病微生物進行鑒定。結果：從病區采集到的各種樣本經過多步分離純化均發現了成團泛菌（Pantoea agglomerans），經室內致病性實驗結果，證實該細菌能夠使得桃果實腐爛。結論：造成桃果實腐爛的致病菌為成團泛菌（Pantoea agglomerans）。

關鍵詞：桃果實;果實腐爛病;致病菌鑒定;形態學觀察;16rDNA序列分析;致病性測定

中圖分類號 S435文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）（02-03）-0098-03

Isolation and Identification of Pathogen of Peach Rot

Qu Xingwu et al.

（Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， China）

Abstract： Objective： to find out the pathogenic microorganism species causing peach tree fruit rot disease in qujialing area. [methods] bacterial culture medium and PDA medium were used to purify microorganisms from rotting peach fruits collected from fruit forests， and morphological observation was made on various microbial isolates. Pathogenic microorganisms were identified by combining 16rDNA sequence analysis and pathogenicity determination.? Results ： all kinds of samples were collected from the ward， Clumps are found through multi-step purification generic bacteria （Pantoea agglomerans）， through indoor pathogenic experiment results， confirmed that the bacteria can make TaoGuo real decay.? conclusion：TaoGuo real decay caused by bacterial pathogens are clouds generic bacteria （Pantoea agglomerans）.

Key words： Peach fruit; Fruit rot; Identification of pathogenic bacteria; Morphological observation; 16rDNA sequence analysis; Pathogenicity test

桃（Amygdaluspersica L.）為薔薇科、桃屬落葉小喬木，其果實味甜多汁，性甘味平，大多數人均可食用，且營養豐富，含蛋白質、糖、纖維素、脂肪、鐵、磷、鈣、胡蘿卜素、維生素B1、有機酸等多種營養成分。湖北屈家嶺地勢較高，夏旱嚴重，近年來因地制宜大力發展桃樹種植，有效地規避了當地嚴重的夏旱，取得了不錯的經濟效益，為當地農戶增收脫貧、帶動地區經濟發展做出了突出貢獻。

在生產中，桃果實可能會受到多種致病菌的侵染，引發多種病害，導致減產和降低商品性。2017—2018年，屈家嶺管理區月寶山桃園種植基地有大規模軟腐病的發生，導致葉片變黃、脫落，桃果實輕則品相變差，重則完全腐壞，導致桃農嚴重減產歉收。為此，筆者通過林間采樣，對引起荊門屈家嶺管理區桃果實腐爛病的病原菌進行了分離、鑒定，明確其種屬，為病害生態防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 帶病材料的采集 2019年5月12日，于荊門市屈家嶺管理區月寶山桃園基地的桃林中，摘取有腐爛現象，或者有疤痕的桃果實新鮮桃果實病樣，以及具有較多疤痕的病葉和病桃樹根病桃樹下土壤等放入采樣袋中，帶回實驗室進行致病菌分離。

1.2 致病菌的分離及純化 取具有明顯腐爛癥狀的桃果實，用自來水沖洗干凈表面的塵土，置于2%漂白粉溶液中消毒3min，用滅菌水沖洗3次后，放在滅菌后的濾紙上晾干。隨后用無菌的解剖刀切取患病和健康交界處組織，擺放于牛肉膏蛋白胨固體培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，分別置于37℃和26℃的恒溫培養箱中培養，24h后觀察細菌的生長情況并記錄。同時，在無菌環境下將取回的土樣用無菌水進行梯度稀釋，并取0.0001及以后2個梯度用滅菌過的移液槍槍頭彎折后涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，分別置于37℃和26℃恒溫培養箱中培養，24h后觀察細菌的生長情況并記錄，48h后觀察真菌生長情況，發現在病健交界處組織的PDA平板中未見明顯的真菌生長情況，無法分離得到真菌。將分離得到的疑似致病菌分別用滅菌過的移液槍槍頭彎折后涂布轉代接種至牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上進行純化，待菌落生長至直徑1～2cm，挑取細菌，轉接至錐形瓶，37℃搖瓶培養24h后，用無菌槍頭吸取適量菌液，進行革蘭氏染色后，置于光學顯微鏡下用油鏡觀察細菌態并拍照記錄。

1.3 疑似病原菌的致病性測定 選取疑似病原菌的培養液進行桃果實的離體接種試驗，觀察并記錄接種后的發病癥狀，并從發病部再次分離純化病原菌，完成柯赫氏法則的驗證。室內離體接種：取新鮮健康的桃果實，洗凈后，用2%漂白粉溶液消毒3min，再用滅菌水沖洗2次，后置于鋪放了滅過菌的濾紙的燒杯內，用無菌移液槍吸取50μL菌液打入桃果實內，以等量的滅過菌的牛肉膏蛋白胨培養基作為對照，每個疑似致病菌接種4個桃果實，2次重復;置于恒溫培養箱中以37℃培養并觀察桃果實是否腐爛。

1.4 致病菌的DNA提取 用試劑盒法進行致病菌DNA的提取：將純化后的病原菌，接種至細菌培養通用培養基中進行培養，37℃搖瓶培養24h，待培養基明顯變渾濁時，取細菌培養液2mL于干凈的離心管中，10000r離心1min，吸凈上清液。向菌體沉淀中添加200μL緩沖液GA，振蕩至菌體全部懸浮。再向管中加入20μLProteinaseK溶液，混勻。用移液槍吸取240μL緩沖液GB加入管中，振蕩15s，70℃水浴加熱10min，待液體變澄清后，離心15s后向管中添加200μL無水乙醇，充分振蕩混勻15s等到出現沉淀后離心15s。將上步所得液體和沉淀都到入1個干凈的吸附柱CB3中，將吸附柱插入1個干凈的收集管中，12000r離心30s，棄去收集管中的廢液不要，再重新把吸附柱CB3插入收集管中。向CB3中加入適量的（600μL）緩沖液GD，12000r離心45s，倒掉收集管中的廢液不用，再重新將吸附柱CB3插入收集管中。向吸附柱CB3中加入適量（600μL）的漂洗液PW，12000r離心30s，倒掉收集管中的廢液，再將吸附柱CB3插入收集管中。再將上一步重新再做1遍后將吸附柱CB3重新插回收集管中，12000r離心2min，棄去收集管中的液體不要。再將吸附柱CB3放在一邊10min，讓吸附柱中殘留的漂洗液充分的揮發出去后再將吸附柱CB3插入全新的離心管中，用移液槍在吸附膜的正中間懸停加入200μL的洗脫液TE，再放在一邊5min后，12000r離心2min，將所有的液體集中到離心管中。再對所提DNA進行純度測定，并保存備用。

1.5 PCR擴增、16rDNA序列測序和分析 利用細菌鑒定通用DNA引物27F/1492R，對分離鑒定提取得到的病原菌的DNA進行擴增（序列分別為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），擴增程序為：預變性97℃，20S;退火51℃，60S;延伸70℃，110S，循環35次;最后70℃，保溫15min。擴增得到的DNA產物用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，利用EB進行染色后利用凝膠成像系統進行觀察并拍照后選取擴增條帶清晰，大小在1500bp左右的PCR產物（圖1），切下進行膠回收后，送到武漢擎科生物科技有限公司進行序列測定。

2 結果與分析

2.1 致病菌的形態學 調查中選取發生腐爛的桃果實，小心摘下，發現病桃果實與健康桃果實相比，病桃果實明顯多處出現褐色病斑，且有明顯的軟化流水現象（圖2）。選取具有代表性的病桃，病葉和樹下土壤，以及健康桃果實，將病桃，健康桃和病葉經表面消毒擺放于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，樹下土壤經震蕩搖勻梯度稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，培養12～24h后挑取分離較好的病原菌菌落轉到新的牛肉膏蛋白胨平板上進行純化培養，從上述培養基中都純化得到細菌分離物2個。根據病原菌菌落形態，可將2株疑似病原菌分為A、B2類，A類疑似病原菌1株，菌落呈圓形點狀，偏乳白色，表面濕潤易挑取;B類疑似病原菌1株，菌落橢圓形，偏黑色或褐色，顏色較A類更深，表面濕潤易挑?。▓D3）。

2.2 疑似致病菌的致病性 室內致病性測定顯示，接種疑似致病菌B的桃果實未出現明顯發病癥狀，接種后5d，僅在接種點傷口周圍略有變色，無明顯的褐化、流水、軟化現象，與無菌水和僅培養基處理的相同（圖4）;接種疑似致病菌A的桃果實出現了明顯的腐爛癥狀，病斑呈褐色，而且有明顯的流水現象（圖5）。依據室內致病性測試結果可知，B類疑似致病菌分離物不是造成桃果實腐爛病的致病菌，A類致病菌分離物才是桃果實腐爛病病的致病菌。對A菌經革蘭氏染色，并于油鏡下觀察得知該菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀（圖6）。

2.3 分離物16rDNA序列的測序結果 使用細菌16rDNA通用引物27F和1492R對分離得到的致病菌的DNA進行擴增，得到長度為1500bp左右的條帶，測序后上傳至NCBI進行BLAST比對，該細菌的16sDNA與成團泛菌（Pantoea agglomerans）具有高度的同源性，相似性達99.4%。結合形態學觀察可以確定該菌為成團泛菌。

3 結論

通過對采集自果園的腐爛桃果實等樣品進行病原物分離、純化和鑒定，利用16sDNA法結合形態學觀察，并通過室內的致病性試驗，確定引起屈家嶺管理區桃果實腐爛的病原物為成團泛菌。由于該菌為革蘭氏陰性菌，故在日常防治中可以在發病初期采用對革蘭氏陰性菌殺滅效果較好的生物農藥進行防治。

（責編：張宏民）