老鸛草乙醇提取物中黃酮類化合物和揮發性組分及其抗菌活性

李 宇，劉海華，劉翠君，由金文，趙仁君，石愛華，何美軍 *

（1. 湖北省農業科學院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2. 恩施職業技術學院，湖北 恩施 445000）

0 引言

【研究意義】抗生素濫用導致大量耐藥菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌等病原菌出現，極大威脅人類健康。有文獻報道全球每年約70萬人死于耐藥菌感染，預計到2050年死亡人數可達到1000萬，僅在美國死于MRSA感染的人數就超過艾滋病和結核病的總和[1,2]。抗生素耐藥性問題已成為威脅全球人類健康的緊迫問題，新型抗生素研發迫在眉睫。【前人研究進展】老鸛草（Geranium wilfordii Maxim）是老鸛草屬（Geranium）植物，味辛、苦；性平；有祛風濕、通經絡、止瀉痢的功效；用于風濕痹痛、麻木拘攣、筋骨酸痛、泄瀉痢疾等癥[3]。現代藥理研究發現老鸛草具有消炎抗氧化、降糖保肝等多種生理功能。鼠掌老鸛草（Geranium sibiricumL.）水煎液對經番瀉葉水煎液處理的小鼠有止瀉作用，對正常小鼠小腸運動有抑制作用，對推進機能亢進的小鼠小腸運動也有抑制作用[4]。老鸛草提取物可顯著降低大鼠幽門結扎型、乙酸灼傷型、乙醇及吲哚鎂辛誘導型的胃潰瘍，能抑制幽門結扎型胃潰瘍大鼠胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性[5]。野老鸛草（Geranium carolinianumL.）水浸提取液對玉米、花生和大豆都具有化感作用，其中對玉米的化感作用最大[6]。為進一步研究老鸛草的生理活性，已有學者從老鸛草中分離鑒定了13個具有多種生理活性的次級代謝產 物：β-谷 甾 醇、1,2,3,6-四-O-沒 食 子 酰-β-D-葡 萄糖、短葉蘇木酚羧酸、原兒茶酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸、胡蘿卜苷、槲皮素、1,3,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖、老鸛草素和corilogin[7?10]。XU等[11]研究發現corilagin通過激活caspase-8、caspase-9、caspase-3和poly ADP-ribose聚合酶蛋白誘導胃癌細胞凋亡，corilagin能通過誘發胃癌細胞自噬（autophagy）和增加細胞活性氧（ROS）等方式抑制胃癌細胞生長。老鸛草素具有抗病毒、抗高血壓、抗高血糖、保護肝臟、抗糖尿病和誘導細胞凋亡等多種生物活性，老鸛草素能通過抑制FAK/Src、ERK1/2途徑衰減MMP-2的表達和活性，抑制口腔癌細胞SCC-9和SCC-14的遷移和入侵[12]。【本研究切入點】目前尚無文獻報道老鸛草乙醇提取物對臨床常見致病菌的抑菌活性、抑菌機理，以及老鸛草乙醇提取物的揮發組分、黃酮類化合物種類。【擬解決的關鍵問題】本研究擬鑒定恩施產區老鸛草乙醇提取物的揮發性組分和黃酮類化合物種類；檢測恩施產區老鸛草乙醇提取物對12株臨床致病菌肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度（MIC）值，以期為新型抗生素的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

老鸛草樣品采集于湖北省恩施市華中藥用植物園，經緯度坐標為109°45′24″ E，30°10′51″ N，經湖北省農業科學院中藥材研究所高級農藝師由金文鑒定為老鸛草（G. wilfordii）。老鸛草是全草入藥，所以本研究以老鸛草全草為研究對象。12株臨床致病菌為：肺炎克雷伯（Klebsiella pneumoniaATCC 13883）、糞鏈球菌（Enterococcus faecalisATCC 29212）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus）、多耐銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、溶 藻 弧 菌（Vibrio alginolyticus XSBZ14）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus epidermidis）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanniiATCC 19606）、大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 29213），由中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室鑒定提供。Agilent 1260高效液相色譜儀（配DAD檢測器），Phenomenex 色 譜 柱（50 mm × 4.6 mm, ODS 5 μm），imark酶標儀（Bio-Rad美國伯樂），Thermo Fisher世爾電導儀（型號：3-star），aglient Technologies 7890A/5975C GC-MS聯用儀，RE-200A旋轉蒸發儀（廣州市星爍儀器有限公司），黃酮標準品楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖均購自阿拉丁試劑公司，其他試劑均為國產分析純。

LB培養基配制：酵母提取物5 g·L?1，胰蛋白胨10 g·L?1，NaCl 10 g·L?1，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min（固體LB培養基加入瓊脂20 g·L?1）。

MH液體培養基配制：牛肉粉2 g·L?1，可溶性淀粉1.5 g·L?1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L?1，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 老鸛草乙醇提取物獲得 10 g新鮮老鸛草樣品粉碎，為充分提取鞣質和黃酮類化合物，以60%乙醇溶液為提取溶劑[13]。料液比1∶50，250 mL乙醇溶液（60%）浸泡18 h，200 w超聲浸提30 min。10 000r·min?1離心取上清，減壓蒸餾得浸膏1.862 g，浸膏得率18.62%。

1.2.2 老鸛草乙醇提取物揮發性成分與黃酮化合物檢測 氣相色譜條件：agilent 19091S-433毛細管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）；升溫程序：60 ℃保持2 min，5 ℃·min?1升至240 ℃，保持2 min，然后10 ℃·min?1升至280 ℃保持2 min，總運行時間23 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；流速為1.8 mL·min?1；進樣量為5 μL不分流。質譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子能量70 ev，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍30～500 amu。檢索譜庫為NIST08.LIB標準譜庫，匹配度≥900，鑒定為同一個化合物，運用面積歸一化法計算老鸛草乙醇提取物各組分相對含量[14]。樣品處理：老鸛草乙醇提取物用甲醇溶解，13 000 r·min?1離心10 min，吸取上清進樣分析，以分析純甲醇進樣作空白對照組，每組樣品重復進樣3次。

高效液相色譜進樣條件：時間0 ～20 min，A相95%～20%；時間20 ～25 min，A相20%～0%；時間25～27 min，A相0%～0%；時間27.1 ～30 min，A相95%～95%。A相：95%H2O、5%甲醇、0.1%乙酸，B相：100%甲醇、0.1%乙酸。老鸛草乙醇提取物用甲醇溶解，13 000 r·min?1離心10 min，吸取上清進樣分析，以分析純甲醇進樣作空白對照組，每組樣品重復進樣3次。利用HPLC外標法[15]測定老鸛草乙醇提取物各黃酮組分含量，將3個標準品楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖配制成6個質量濃度梯度（1.0、2.0 、4.0 、8.0 、16.0 、32.0 μg·mL?1）的混標，測定儀器信噪比（S/N），當各標準溶液稀釋至信噪比3＜S/N＜10時，以該溶液濃度計算儀器檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），得到3個標準品的標準曲線、R2、檢出限和定量限。對各標準品進行精密度和重復性實驗，每個混標重復檢測6次，計算相對標準偏差（S）。檢測加入標量的各樣品的黃酮組分含量，計算回收率和相對標準偏差，重復檢測6次。外標法檢測老鸛草乙醇提取物中各黃酮組分的含量計算公式：

C：老鸛草樣品中黃酮組分含量；n：HPLC檢測濃度；m：老鸛草樣品干重

1.2.3 老鸛草乙醇提取物抗菌活性測試 用濾紙片法[16]測試老鸛草乙醇提取物對12株臨床致病菌的抑菌活性，取20 μL培養至OD600為0.6的測試菌菌液與20 mL LB固體培養基混合均勻倒平板。取5 μL老鸛草乙醇提取物（二甲基亞砜DMSO溶解）于濾紙片上，使濾紙片完全吸收，將濾紙片置于混有菌液的培養基上，另設氨芐青霉素（100 mg·mL?1）作陽性對照、DMSO作陰性對照，37 ℃培養12 h，測抑菌圈。37 ℃培養12 h，測抑菌圈。參照抗生素藥敏標準：高敏（抑菌圈直徑＞16 mm）、中敏（10～16 mm）、輕敏或耐藥（＜10 mm）。采用微量肉湯稀釋法測定老鸛草乙醇提取物對致病菌的MIC值，按美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M07-A9[17]的標準操作程序，在12列8行規格的96孔板上依次添加以下內容：第3～12列的每孔加入含乙醇提取物樣品的MH液體培養基100 μL，設置乙醇提取物終質量濃度分別為128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg·mL?1。第1列加入200 μL MH液體培養基， 第2列加入100 μL MH液體培養基（陽性生長組），將培養好的菌液稀釋1000倍， 2～12每孔加入稀釋菌液100 μL。另設氨芐青霉素（100 mg·mL?1）作藥物陽性對照組。37 ℃培養16 h后使用imark酶標儀檢測OD600，根據CLSI M100-S26[18]標準：與陽性生長對照管比較抑制80%細菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值。

1.2.4 數據處理 所有試驗數據運用SPSS 19.0 軟件進行數據統計分析，試驗數據以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 老鸛草乙醇提取物分揮發性成分鑒定與相對含量測定

通過GC-MS分析共從老鸛草乙醇提取物中檢測到223個離子峰，通過NIST08.LIB標準譜庫檢索，共從老鸛草乙醇提取物中鑒定出18個揮發性物質（表1），主要為脂肪烴（5.72%）、脂肪酸（17.09%）、生物堿（1.15%）。脂肪烴類化合物有6-methyloctadecane（0.56%）、2,6,10-trimethyltetradecane （0.62%）、octadecane （0.97%）、octacosane （1.85%）、（E）-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol （1.50%）、2-methylhexadecan-1-ol （0.52%）、10-octylnonadecane （0.32%）共8個（表1）。脂肪酸類化合物有docosyl docosanoate（0.42%）、methyl 11-（3-pentyloxiran-2-yl） undecanoate（0.96%）、（Z）-7-methyltetradec-8-en-1-yl acetate（0.92%）、methyl palmitate （7.91%）、palmitic acid（0.45%）、methyl （E）-octadec-9-enoate （4.93%）、methyl 12-methyltetradecanoate （0.53%）、oleic acid（0.97%）共8個，其中化合物methyl （E）-octadec-9-enoate、methyl （E）-octadec-9-enoate、oleic acid為不飽和脂肪酸（表1），飽和脂肪酸類化合物具有供應能量、增加膽固醇濃度及調節低密度脂蛋白（LDL）代謝等多種生理功能，不飽和脂肪酸類化合物具有降低膽固醇、調節血脂、降低血壓、抗腫瘤、保護視力等多種生理功能[19]。

表 1 老鸛草乙醇提取物組分揮發性成分及其含量測定結果Table 1 Volatiles in G. wilfordii ethanol-extract

（5.β.）Pregnane-3,20.β.-diol,14.α.,18.α.-[4-methyl-3-oxo-（1-oxa-4-azabutane-1,4-diyl）]-, diacetate （1.15%）是首次在老鸛草乙醇提取物中鑒定的揮發性生物堿，生物堿具有抗腫瘤、消炎、抗病毒、抗血小板凝集、抗心律失常及抗高血壓等重要生理功能[20]。

2.2 老鸛草乙醇提取物黃酮化合物鑒定與含量測定

通過HPLC檢測得到黃酮標準品楊梅苷（Rt 16.498 min）、花旗松素（Rt 17.508 min）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（Rt 17.978 min）與老鸛草乙醇提取物中3個吸收峰（1） Rt 16.506 min、（2） Rt 17.503 min、（3） Rt 17.981 min保留時間一致（圖1）。

黃酮標準品楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖與老鸛草乙醇提取物中3個吸收峰（1、2、3）的吸收光譜分別對應一致（圖2），通過保留時間和吸收光譜數據鑒定這3個吸收峰分別為楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖。

HPLC外標法測量3個標準品的標準曲線、重復性、檢出限、定量限如表2所示，線性相關性好（R2≥0.999 0）。通過配制本底含量標準品濃度溶液，加入定濃度的標準品，HPLC檢測，獲得標準品的加標回收率為98.56%～101.05%，相對標準偏差為0.55%～1.50%（表2）。

利用HPLC外標法檢測老鸛草乙醇提取物各黃酮化合物含量：花旗松素（3.72 mg·g?1）、楊梅苷（2.56 mg·g?1）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（5.56 mg·g?1），加標回收率為99.24%～101.98%，相對標準偏差為0.85%～1.12%（表3）。

圖 1 老鸛草乙醇提取物與黃酮標準品保留時間對比Fig. 1 Retention times of G. wilfordii ethanol-extract and flavonoid standards

圖 2 老鸛草乙醇提取物與黃酮標準品光譜對比Fig. 2 Spectrograms on G. wilfordii ethanol-extract and flavonoid standards

表 2 標準曲線、重復性及檢測限（means±SD，n=6）Table 2 Regression equation, correlation coefficient, and detection limit on measurements (means±SD, n=6)

2.3 老鸛草乙醇提取物抗菌活性粗篩

濾紙片活性測試結果顯示老鸛草乙醇提取物對12株臨床致病菌具有良好的抗菌效果，老鸛草乙醇提取物對糞鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及鮑曼不動桿菌有高敏抑制活性（抑菌圈≥16 mm），其MIC值分別為1.0、1.0 、1.0 、2.0 mg·mL?1。對肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、多耐銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌有中敏抑制活性（抑菌圈直徑：11 ～15 mm），其MIC值分別為4.0 、4.0 、4.0 、4.0 、8.0 、4.0、4.0 mg·mL?1。對藤黃微球菌有微弱抑菌活性（抑菌圈≤10 mm），其MIC值為16.0 mg·mL?1（表4）。

表 3 老鸛草乙醇提取物各黃酮化合物含量表（means±SD，n=6）Table 3 Flavone contents in G. wilfordii ethanol-extract

表 4 老鸛草乙醇提取物的抗菌活性（means±SD，n=3）Table 4 Antibacterial activity of G. wilfordii ethanol-extract

3 討論與結論

細菌耐藥性問題的日益惡化和我國限抗和禁抗政策的落地，讓抗生素替代品的研究越發迫切[21]。Kim等[22]學者曾用239種中草藥乙醇提取物對7株多重耐藥金黃色葡萄球菌的廣譜抑菌活性進行系統評價，發現了74種中草藥具有良好的抑菌活性，說明傳統中草藥來源的活性成分具有開發成為抗菌藥物替代物的良好潛力。

老鸛草乙醇提取物被發現具有多種生物活性，對結腸癌細胞的增殖具有抑制作用[23]，能抑制幽門結扎型胃潰瘍大鼠胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性[5,11]，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、停乳鏈球菌、雞沙門氏桿菌的抑菌效果良好[24]。老鸛草乙醇提取物的主要活性成分為鞣質類、黃酮類、有機酸和揮發油類化合物[25,26]，程小偉等[27]進一步研究發現老鸛草乙醇提取物中的山柰酚、沒食子酸衍生物和黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌活性。 楊秀芳等從老鸛草屬植物中共分離、鑒定了約39個鞣質類化合物、35個黃酮類化合、8個有機酸類化合物[28]。研究表明老鸛草中鞣質具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降糖保肝等作用[29]。

本研究首次發現恩施地區老鸛草乙醇提取物具有優良抗菌活性和廣譜性，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌及鮑曼不動桿菌有高敏抑制活性，對肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、多耐銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌有中敏抑制活性。本研究首次鑒定了恩施地區老鸛草乙醇提取物的揮發成分主要為脂肪烴（5.72%）、脂肪酸（17.09%）、生物堿（1.15%）。首次測定了恩施地區老鸛草乙醇提取物中的3個黃酮類化合物的含量：花旗松素（3.72 mg·g?1）、楊 梅 苷（2.56 mg·g?1）、槲 皮 素-3-O-β-D-葡萄糖（5.56 mg·g?1）。

恩施地區老鸛草乙醇提取物具有優良抗菌活性和廣譜性，為開發新型植物來源的抗生素提供了重要參考。但是老鸛草乙醇提取物中發揮抑菌功能的活性成分和抑菌機制，還有待進一步分析研究。