實時熒光定量PCR在HLA-B*5801等位基因檢測中的性能評價

吳 潔 伊 潔 甘 勇 徐英春*

目前，我國高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)的患病率逐年增高，并呈年輕化趨勢，且HUA是痛風的主要風險因素[1]。當血尿酸濃度過高時，單鈉尿酸鹽晶體就會在關節、軟骨和腎臟等部位沉積，導致痛風發生。別嘌醇(Allopurinol)是常用的抑制尿酸合成，治療痛風的一線藥物，是目前唯一的黃嘌呤氧化酶抑制劑。然而，該藥可引起嚴重皮膚不良反應(severe cutaneous adverse reactions，SCARs)，如史蒂芬瓊森癥候群(Stevens-Johnson syndrome，SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)等，病死率高達20%～40%，尤其是伴有腎功能不全的患者，預后差，病死率高[2]。人類白細胞抗原B位點5801(human leukocyte antigen，HLA-B*5801)等位基因與別嘌醇引發的SCARs呈現很強的相關性，尤其在我國漢族人群中，HLA-B*5801陽性率較高，幾乎所有超敏反應的患者都是HLA-B*5801等位基因的攜帶者，患者服用別嘌醇前進行HLA-B*5801等位基因檢查，有助于預防別嘌醇所致SCARs的發生[3-4]。本研究旨在ISO15189實驗室認可體系下，對使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)法檢測HLA-B*5801等位基因進行方法學評價，為此項目的臨床推廣和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究資料

選取2017年6月至2017年9月在北京協和醫院就診的20例高尿酸血癥患者，其中男性17例，女性3例；年齡23～64歲；平均年齡(42.1±15.2)歲；分別留取每例患者EDTA-K2抗凝靜脈全血樣本各500 μl(留取每例患者血常規檢測后剩余全血500 μl)。

1.2 儀器與試劑

采用SLAN96P型熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司)；3730XL型測序儀(美國應用生物系統公司)；Thermo Multiskan GO核酸分析儀(美國Thermo Fisher公司)；NP968型全自動核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)；全血提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)。HLA-B*5801基因檢測試劑盒(熒光PCR法)(蘇州曠遠生物分子技術有限公司，國械注準20173403073)。

1.3 檢測方法

取200 μl的EDTA-K2抗凝外周血，使用NP968全自動核酸提取儀及配套天隆全血提取試劑盒，按照說明書操作提取基因組DNA，使用Thermo Multiskan GO核酸分析儀測定提取DNA的濃度和純度，取濃度水平在10～100 ng/μl，OD260/OD280在1.7～2.0之間的樣本用于后續實驗，置-20 ℃保存。按照HLA-B*5801基因檢測試劑盒操作步驟，采用實時熒光PCR對HLA-B*5801等位基因進行擴增檢測。

1.4 評價指標

將20例患者EDTA-K2抗凝靜脈血樣本送上海華大公司，用測序方法(金標準)進行驗證，兩種方法進行比對，計算實時熒光PCR法檢測結果與測序結果的總符合率、陽性符合率和陰性符合率，評價方法的準確性；選擇已知HLA-B*5801等位基因陽性和陰性的DNA樣本各2例，分別批內批間重復擴增10次，評價方法的精密度；對1例HLA-B*5801等位基因陽性DNA樣本進行濃度梯度稀釋，獲得濃度為80 ng/μl、40 ng/μl、20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl和0 ng/μl的系列DNA樣本，采用實時熒光PCR方法對其進行檢測，評價方法的最低檢出限。

1.5 數據分析

實時熒光定量PCR法結果判定：每個樣本目的檢測信號為熒光基團FAM，內參信號為熒光基團VIC。分析FAM和VIC信號的Ct值，并計算樣本檢測FAM信號Ct值與VIC信號Ct值的差值，其計算為公式1：

式中當內參Ct(VIC)≤20時，ΔCt≤4應判定HLA-B*5801陽性；ΔCt＞4則判定為陰性。精密度實驗中重復擴增樣本Ct值的變異系數(coefficient of variation，CV)按照平均值÷標準差進行計算。

2 結果

2.1 重復性

實時熒光定量PCR法對4份DNA樣本的HLA-B*5801等位基因分別完成10次批內批間重復擴增，每份樣本重復檢測結果完全一致，所得Ct值的CV(%)均＜6.5%，見表1。

表1 實時熒光PCR擴增檢測精密度

2.2 準確性

在20份DNA樣本的HLA-B*5801等位基因檢測中，有8例HLA-B*5801陽性和12例HLA-B*5801陰性，實時熒光定量PCR檢測結果與金標準測序法結果的符合率為100%，其結果見圖1和圖2。

2.3 最低檢出限

圖1 HLA-B*5801陽性和陰性樣本的實時熒光定量PCR結果

圖2 測序軟件分析判讀HLA-B*5801陽性和陰性樣本結果

濃度梯度稀釋DNA樣本的檢測結果顯示，實時熒光定量PCR能夠對濃度低至2.5 ng/μl的DNA樣本進行有效擴增，檢出HLA-B*5801等位基因，其最低檢測限為2.5 ng/μl的DNA。

3 討論

嚴重藥物不良反應(serious adverse drug reaction，SADR)在全球范圍內造成高病死率、高醫療負擔和高醫患糾紛。據中國食品藥品監督管理總局(China Food and Drug Administration，CFDA)統計，2016年全國藥品不良反應監測網絡收到《藥品不良反應/事件報告表》143萬份，其中新發和SADR報告42.3萬余份，安全用藥已成為迫切需要解決的公共醫療衛生問題[5]。

別嘌醇是目前臨床常用治療高尿酸血癥、痛風以及急性尿酸性腎病的一線藥物，臨床應用發現其可引發藥物過敏反應，藥疹發生率為2%～5%，約有0.1%～0.4%的患者用藥后會出現嚴重皮膚過敏反應[6]。HLA-B屬于HLA I類基因，基因長度約為3.3 kb，有7個外顯子，中國人群中HLA-B有超過800種等位基因，HLA-B*5801屬于B類58亞型，01號等位基因。近年來，越來越多的研究發現HLA-B*5801等位基因與別嘌醇引發的SADR反應相關，尤其在高HLA-B*5801基因頻率的亞洲人群中[7-8]。2012年，美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)建議：亞裔人群在使用別嘌醇前，應該進行HLA-B*5801等位基因快速PCR檢測[9]。

根據“藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南”的要求，醫學實驗室在開展臨床檢測前均需對檢測體系進行嚴格的方法學評價和性能驗證，并建立相應的性能規范，便于后續日常檢測過程中的校準和室內質量控制工作，以保證檢驗結果的準確和可靠[10]。HLA-B*5801等位基因檢測屬于定性檢測項目，參照美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的EP12-A2指南，定性檢測方法的最基本性能驗證指標包括精密度(重復性)、準確度(突變型的檢測能力)和檢測限3個方面[11]。本研究中的重復性驗證選取HLA-B*5801陽性標本及陰性標本各2例，分別進行2 d共10次測定，陰性和陽性符合率均為100%。準確性驗證分別使用實時熒光定量PCR法和測序法進行HLA-B*5801等位基因測定，以測序法為金標準來評價實時熒光定量PCR法，且結果顯示，實時熒光定量PCR法和測序法檢測結果一致，可準確靈敏地檢測出HLA-B*5801陽性的患者。

4 結論

實時熒光定量PCR法與測序法相比，其操作簡便，檢測速度快，成本較低，在臨床大批量的快速篩查工作中更為適用。最低檢出限驗證結果顯示，實時熒光PCR能檢出稀釋濃度低至2.5 ng/μl的DNA陽性樣本，表明該方法具有足夠的檢測能力。

本研究通過對HLA-B*5801等位基因的重復性、準確性、檢測下限等方法學性能評價和分析，證實實時熒光定量PCR系統可以滿足目前HLA-B*5801等位基因檢測的臨床需求，并且經濟簡便，適用于臨床常規檢測。