人類肝炎病毒的進化生物學

王榮明 江建寧

全球每年約有130萬人死于病毒性肝炎[1]。這些死亡與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染引起的肝硬化(LC)和肝細胞癌(HCC)以及甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的急性肝炎和肝衰竭有關[1-2]。同時，全球約有5%的HBV感染者同時感染了丁型肝炎病毒(HDV)[3]。在過去幾十年中，除靈長類外，在其他動物身上還發現了多種與人類肝炎病毒相關的非人類肝炎病毒。本文將介紹過去幾十年發現的多種人類肝炎病毒的動物同源物，并基于人類和非人類肝炎病毒的獨特特性，分析人類肝炎病毒的進化。

一、非人類肝炎病毒發現的新時代

過去幾十年，由于新測序技術的發展以及人們對人畜共患病病原體的關注，大量非人類肝炎病毒被發現。1978年，在美國土撥鼠中發現了一種遺傳性遠親HBV，即土撥鼠肝炎病毒(WHV)。隨后，又相繼發現了鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、猿類中的HBV變種以及毛猴乙型肝炎病毒(WMHBV)等不同的HBV物種。20世紀90年代，人們在獼猴體內檢測到一種獨特的HAV，并從豬體內提取到HEV。1995年從實驗室狨猴中分離出一種與HCV有遠親關系的非人靈長類動物(NHP)病毒，即GBV-B。2013—2015年間，從家貓體內也檢測到了HBV相關病毒。最近，在卷尾猴中發現了一種獨特的HBV物種，即CMHBV[4]。同時，在爬行動物、魚類和兩棲動物中也檢測到與HBV有遠親關系的內源性和外源性肝炎病毒。2012年，在馬身上發現了HCV相關病毒，并證實了這種病毒偶爾會由馬向狗和驢傳播[5]。此后不久，在蝙蝠、牛和黑白疣猴體內也檢測到高度多樣化的HCV相關病毒。2015—2018年間，在各種哺乳動物物種中發現了大量與HAV相關的病毒，主要包括蝙蝠和嚙齒動物，還有樹鼩、有袋動物和海豹。最近，在鴨和蛇體內發現類似HDV的病毒，在野豬、駱駝和兔子中發現了人畜共患病的HEV基因型。此外，在蝙蝠、雪貂、嚙齒動物、鳥類和魚類中也發現了不同的HEV相關病毒。總之，所有的人類同源肝炎病毒都陸續被發現存在于不同的動物物種中。相比人類肝炎病毒，我們對這些非人類宿主的肝炎病毒了解很少。

二、肝炎病毒獨特的保守性和再生能力

通常，人類肝炎病毒和非人肝炎病毒在基因組核酸結構、開放閱讀框(ORF)組成、基因組長度和非編碼區存在和類型等主要基因組特性上彼此相似，但是，來自同一病毒科和屬的病毒之間也存在顯著差異。

(一)動物肝炎病毒的包膜可能不穩定 最新研究表明，以前被認為是無包膜病毒的HAV和HEV，在血液中以包膜形式存在，稱為準包膜[6]。與包膜病毒相比，在HAV和HEV的準包膜中沒有發現病毒編碼的蛋白質，一些非靈長類的HAV和HEV相關病毒(hepatoviruses, hepeviruses，以下稱甲型肝炎病毒和脊椎動物戊型肝炎病毒)也缺乏參與準包膜進化的關鍵基因組結構，這就提出了準包膜病毒是如何進入易感細胞的問題。相比之下，HBV相關病毒(hepadnaviruses, 以下稱嗜肝DNA病毒)是包膜病毒，但最近發現魚類是一種無包膜的嗜肝DNA病毒姐妹科Nackednaviridae的宿主，這一發現表明在能夠感染哺乳動物并最終感染人類的嗜肝DNA病毒中出現了包膜的再生[7]。HCV感染的一個標志是脂質體病毒顆粒的形成。馬丙型肝炎病毒外殼蛋白與細胞內脂質成分有關，這表明HCV與非人類HCV相關病毒(hepaciviruses)的復制相似[8]。因此，在動物肝炎病毒中，包膜和準包膜的存在可能不穩定。

(二)肝炎病毒進化過程中發生重組 當一個細胞同時感染了在復制過程中相互作用的兩種不同病毒時，病毒之間可能發生重組。所有的人類肝炎病毒都可發生重組。最近發現的大量非人類肝炎病毒使我們懷疑人類肝炎病毒與其動物同源物之間可能發生重組。有證據表明，HAV是許多來自不同順序宿主的不同源病毒序列的重組，其內部核糖體進入位點的5’基因組末端的變異提示重組可能涉及不同物種的病毒[9]。在靈長類動物和鳥類嗜肝DNA病毒中也發現了不同宿主物種的病毒重組。對于非人類肝炎病毒，尚未證實不同宿主之間可發生重組。然而，類似于HAV，有證據表明來自不同宿主序列的脊椎動物戊肝病毒發生了重組，提示屬于不同屬的病毒在5’基因組末端可能發現重組[10]。與駱駝科動物相關的HEV基因型7和8中發現了在編碼非結構蛋白和結構蛋白的ORF邊界處存在重組[10]?？傊?，重組可能是肝炎病毒譜系中的常見事件。

三、肝炎病毒感染模式的進化穩定

(一)傳播途徑的穩定性 人類肝炎病毒的傳播途徑各不相同。HAV和HEV主要通過腸道途徑傳播，HBV和HDV通過血液和其他體液傳播，HCV主要通過輸血、注射毒品時共用注射器和在醫療過程中重復使用注射器傳播。研究發現，HAV和脊椎動物HEV可從非人類肝炎病毒宿主的糞便中排出。對于非靈長類動物宿主，已知嗜肝DNA病毒在嚙齒動物和鳥類可有效垂直傳播，而蝙蝠或貓嗜肝DNA病毒的傳播途徑仍然未知。同樣，非人類HCV的傳播途徑尚不清楚。在小型哺乳動物中HCV可能通過交配、咬傷和抓撓傳播。在馬中已經發現了馬丙型肝炎病毒的腸外傳播，傳播途徑可能包括性傳播和獸醫的操作[11]。總之，人類腸道肝炎病毒及其他動物的腸道病毒的傳播途徑在進化上似乎是穩定的，與人類肝炎病毒接近，而非人類嗜肝DNA病毒和HCV的傳播途徑卻鮮為人知。

(二)嗜肝性的決定因素尚不清楚 對于人類HAV和HEV，目前尚不清楚決定病毒嗜肝性的病毒和宿主因素。近來在蝙蝠的肝臟和脾臟中檢測到幾乎相同病毒數的HAV，這是由于含有HAV遺傳物質的巨噬細胞被隔離引起的[12]，還是由于肝外病毒復制引起的仍有待確定。對于人類HBV和HDV，研究表明,在與肝素-硫酸蛋白聚糖低特異性結合后，它們通過?；悄懰徕c共轉運多肽(人受體為NTCP，動物同源受體為Ntcp)介導進入肝細胞，這些特異性受體可能調控HBV和HDV的嗜肝性。禽類嗜肝DNA病毒沒有表現出嚴格的嗜肝性，這可能是其受體不同于人類HBV[13]。對于HCV，決定其嗜肝性的一個重要因素是它與肝miR-122的相互作用[14]。迄今已知的所有非人類肝炎病毒在其5'-基因組末端含有至少一個miR-122結合位點，這可能有助于這些病毒的明顯保守的嗜肝性[15]?？傊?，嗜肝性是非人類肝炎病毒的一個廣泛存在但不完全保守的性質。由于決定人類肝炎病毒嗜肝性的因素尚不完全清楚，因此運用這些新發現的非人類肝炎病毒進行實驗感染動物的系統研究有助于研究肝炎病毒的嗜肝性。

(三)肝炎病毒導致肝癌的機制不同 慢性肝炎病毒感染可引起肝硬化和肝癌。在人類中，慢性HBV感染導致肝細胞癌占15%～40%，慢性HCV感染約占2.5%。研究發現,在出生時感染了WHV的土撥鼠和感染了遺傳相關地松鼠肝炎病毒的地松鼠發生HCC的風險很高。土撥鼠的腫瘤發生主要是通過靶向將嗜肝DNA病毒DNA插入宿主DNA從而激活N-myc基因引起的，而地松鼠的腫瘤發生與c-myc基因的激活有關[16]。對于人類HBV，在病毒復制過程中，HBV DNA片段可以整合到肝細胞基因組中[17]。然而目前在人類HBV中尚未鑒定出與腫瘤發生相關的特異性整合位點。有研究報道，病毒HBx蛋白通過與宿主細胞的復雜相互作用可促進腫瘤發生，如改變宿主原癌基因和抑癌基因的表達，通過激活周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶通路刺激細胞進入細胞周期，阻斷細胞凋亡[18]。在嗜肝DNA病毒進化過程中，HBx可在哺乳動物中再生。盡管HBx蛋白在非人類嗜肝DNA病毒感染中的作用尚不清楚，但哺乳動物嗜肝病毒中HBx基因的保守性表明，HBx介導的腫瘤發生可能在多種哺乳動物中存在。與HBV相反，在HCV感染期間不會發生病毒遺傳物質整合到宿主基因組中。HCV的核心蛋白和非結構蛋白NS3和NS5a通過改變參與多種致癌途徑的宿主基因的表達來促進HCC發展。但是，目前未在任何非人類HCV宿主中觀察到HCC發生，可能HCV導致的腫瘤發生是人類HCV感染所特有的，也可能因為研究動物的壽命相對較短。最近，在馬和牛身上已經發現了HCV的慢性感染病程，研究這些大型和相對長壽的動物是否會發展為HCC是很有意思的。因此，感染肝炎病毒的動物是否以及如何發展成HCC目前尚不清楚，需要進行長期感染研究和縱向流行病學調查。

四、肝炎病毒的進化起源

(一)非人類肝炎病毒的古老起源 肝炎病毒存在于多種脊椎動物類群中，提示了脊椎動物和肝炎病毒之間存在有長期進化聯系。脊椎動物的共同祖先可以追溯到奧陶紀，大約450 mya，從那里它們變成魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物。在節肢動物中也存在與HAV、嗜肝DNA病毒、HCV和HEV具有遺傳或結構關系的病毒元件[19]。節肢動物是進化上古老的動物，大約進化了500 mya。這些最新研究進一步證實了肝炎病毒的古老的進化起源。

(二)人類肝炎病毒不太可能起源于NHP 由于宿主的遺傳親緣關系會促進病毒的跨物種傳播，我們可以假設人類肝炎病毒起源于NHP，類似于猴子和猿的艾滋病毒起源。事實上，在NHP中發現了HAV、HBV和HCV的親屬。但是在靈長類HBV中，來自舊大陸類人猿的多種菌株與人類菌株混雜，這些病毒之間的重組暗示著過去存在跨物種傳播[20]。然而，與舊大陸類人猿的病毒相比，人類病毒的遺傳多樣性相對較大，這暗示了HBV起源于人類干細胞譜系。此外，來自NHP的HCV與人類HCV沒有共同的祖先。我們目前對靈長類動物HAV，HBV和HCV多樣性的了解不支持人類肝炎病毒起源于NHP這一假設。目前，人類肝炎病毒的進化祖先仍是未知的。據推測，人類及其靈長類祖先的人畜共患病并非最近才在舊大陸發生。在未來幾年應該能找到進一步的證據來闡明人類肝炎病毒譜系。

五、結語

在過去的幾十年里，人類肝炎病毒的研究取得了重大進展。然而，對肝炎病毒的演變和發病機制的關鍵方面仍知之甚少。與此同時，之前所確定的肝炎病毒的一些特性也受到了質疑，例如肝炎病毒與人類宿主的唯一關聯性、嗜肝性的決定因素以及典型的包膜病毒和非包膜病毒的區別?？梢灶A料，新發現的動物病毒將有助于闡明有關肝炎病毒發病機制的關鍵問題。盡管肝炎病毒的發現已有40～60年的歷史，但它們的進化起源仍然是個謎。最近發現的高度多樣化的動物同源物暗示了非人類宿主中所有人類肝炎病毒的進化起源。這些起源可能相當古老，涉及老的脊椎動物譜系，如爬行動物，兩棲動物，鳥類和魚類，甚至可能是節肢動物。肝炎病毒進化結合了長期的病毒-宿主關聯和跨物種傳播，未來病毒相關的發現將確定肝炎病毒進化中缺失的環節，并可能確定人類肝炎病毒的直接祖先。

世界衛生組織近年提出了消滅乙型和丙型病毒性肝炎的新概念。值得注意的是，人類消滅肝炎病毒的先決條件是缺乏動物宿主。在非人類宿主中發現的肝炎病毒同源物可能意味著在成功根除HBV和停止乙型肝炎疫苗接種后，病毒有可能重新被傳播給人類。人類肝炎病毒的多種動物同源物的發現使我們能夠概念化新的動物模型，用于對急需治療的慢性乙型肝炎和丙型肝炎進行臨床前檢測，并能揭示肝炎病毒發病機制的許多未知之處。