病毒性角膜內皮炎的研究現狀

李燕玲，蘇旺銘，何小輝

0引言

病毒性角膜內皮炎是一種發生于角膜內皮的急性非化膿性炎癥，以特征性的基質水腫，而無基質浸潤及新生血管，僅出現于基質水腫區的角膜后沉著物(keratic precipitates,KP)為特征，常伴小梁網炎、虹膜睫狀體炎，其臨床表現復雜多樣，臨床誤診率高。1982年首次報道2例以來，病毒性角膜內皮炎逐漸受到人們的重視，國內外均有越來越多的報道。現將其研究現狀作一概述。

1病毒性角膜內皮炎的誘因和病因及發病機制

1.1病毒性角膜內皮炎的誘因Shimomura[1]通過一項研究發現壓力尤其春夏季時、缺乏睡眠、肩部僵硬不適、身體的疲勞是誘發單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)激活的關鍵因素，此外還包括暴露于紫外線輻射、月經期、發燒、濫用糖皮質激素和外傷[2]，國外一些研究證明單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)的發生率在老年人更高[3-4]，故認為年齡可能也是發生病毒性角膜內皮炎的一個危險因素。

1.2病毒性角膜內皮炎的病因1985年，Robin等[5]首次在進展性角膜內皮炎患者的房水中分離出HSV，并使用免疫熒光技術在前房細胞中檢測到了HSV-1型抗原。2002年Madhavan等[6]從1例雙眼角膜內皮炎患者房水中分離出水皰樣病毒。有學者[7-9]在2009、2010、2011年利用實時PCR檢測出水痘帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus,VZV)、人類皰疹病毒-7(human herpes virus-7,HHV-7)、人類皰疹病毒-8(human herpes virus-7,HHV-8)，病毒性角膜內皮炎可由多種病毒引起，而HSV-1是最常見的致病病毒。

1.3病毒性角膜內皮炎的發病機制病毒性角膜內皮炎的發病機制存在兩大學說：病毒感染學說和免疫炎癥學說。相繼在患者房水中檢測出HSV-1、水皰樣病毒、流行性腮腺炎病毒、巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、VZV、HHV-7、HHV-8的DNA，至此發現病毒感染可能是病毒性角膜內皮炎的重要發病機制。2002年Zheng等[10]通過在兔的角膜上成功建立了HSV角膜內皮炎的模型，也揭示了HSV-1感染角膜內皮至少是角膜內皮炎的一個病因，前房相關性免疫偏離(anterior chamber-associated im mune deviation， ACAID)在病毒性角膜內皮炎中扮演一個關鍵性的角色。ACAID指眼源性抗原信號通過眼局部的抗原遞呈細胞經血到達脾臟時，選擇性地激活調節性 T 細胞抑制抗原特異性的遲發型超敏反應和補體結合性抗體的發生發展，保留抗原特異性致敏的細胞毒T淋巴細胞反應。 而一些體外試驗證明了TOLL樣受體-9引起的分子反應和調節性T細胞在病毒性角膜內皮炎中也發揮重要作用[11-12]。目前主流觀點認為病毒性角膜內皮炎是由病毒感染和病毒誘發的遲發型超敏反應共同作用的結果[13-14]。

2病毒性角膜內皮炎的臨床表現及分類

2.1病毒性角膜內皮炎的臨床表現病毒性角膜內皮炎表現為視力顯著下降，結膜睫狀充血或混合性充血，可有角膜上皮小水泡，角膜基質呈局限性或彌漫性水腫，而無基質浸潤及新生血管，KP呈塵狀、灰白色，脂狀或色素樣，呈特征性分布，僅出現于水腫區，后彈力層皺褶，部分患者前房閃輝，伴發小梁網炎時可有眼壓升高，但常低于40mmHg，反復發作導致角膜內皮失代償時可發生角膜大泡。由于臨床表現復雜多樣，常被誤診為急性閉角型青光眼、虹膜睫狀體炎、青光眼睫狀體炎綜合征、免疫性基質型角膜炎以及內眼手術特別是白內障手術后的內皮損傷。

2.2病毒性角膜內皮炎的分類國內外關于病毒性角膜內皮炎的分類多種多樣，目前較統一的分類是根據KP的分布情況將其分為盤狀型、彌漫型及線狀型三類[15]。線狀型臨床上較少見，其內皮細胞快速大量丟失，是最嚴重的類型，其KP類似角膜內皮排斥線，呈線狀排列，向心性發展，KP 和角膜緣之間有基質和上皮水腫，KP線內外角膜水腫邊界清晰，線狀型角膜內皮炎可單獨發生于穿透性角膜移植術后或白內障術后，引起的病原體通常有HSV和CMV。當KP呈錢幣樣排列時是CMV角膜內皮炎的特征性改變。盤狀型是最常見的類型，角膜中央或旁中央呈圓形或盤狀基質水腫，邊界清晰，明顯劃分出感染區和非感染區，水腫區有大量KP,引起的病原體通常有HSV和VZV，角膜內皮細胞丟失不明顯。彌漫型相對較少見，通常出現于流行性腮腺炎病毒全身感染時，角膜彌漫性水腫，KP也彌漫性分布，當角膜內皮細胞密度下降到一定程度時，角膜水腫也在幾周內消失，此型機制尚不明確，可能是病毒血癥時病毒進入前房有關[16]。

3病毒性角膜內皮炎的輔助診斷技術

3.1病毒分離病毒分離法曾為診斷病毒感染的“金標準”，但檢出率較低，花費時間長，其對標本運輸、細胞培養及實驗室設備要求較高，而且當病毒處于潛伏期，未進行復制時，可造成假陰性的結果。在臨床上無法推廣，只能在有條件的醫院或實驗室開展。

3.2角膜內皮鏡檢查病毒性角膜內皮炎時角膜內皮細胞表現為體積普遍增大、數目減少、大小不等、細胞邊界不清、六邊形細胞比例減少、細胞呈多形性、形態不規則[17-18]。陳凱等[19]通過對各型角膜內皮炎藥物治療前后內皮細胞的觀察發現盤狀型、線狀型、彌漫型內皮細胞損傷程度不同，需要藥物治療的時間、恢復時間不同，彌漫型內皮細胞損傷最為嚴重，需要恢復的時間最長。

角膜內皮鏡檢測可觀察內皮細胞形態改變，可判斷內皮損傷嚴重程度，以及觀察治療前后病情恢復情況，但是缺乏特異性，多種疾病有共同表現，因此無法明確病因，只能作為一種輔助檢查方法。

3.3活體共聚焦顯微鏡病毒性角膜內皮炎活體角膜共聚焦顯微鏡下(invivoconfocal microscope, IVCM)表現為病變區角膜上皮細胞腫脹，細胞間出現大小不一的空泡，上皮下神經纖維叢密度下降，纖維變細，基質層可見樹突狀的朗格漢斯細胞聚集，基質細胞腫脹，活化，初發者基質內無炎癥細胞浸潤，無瘢痕，而病情遷延者基質層可見炎癥細胞浸潤甚至瘢痕形成，內皮細胞不同程度腫脹，失去多邊形結構，邊界模糊，核增大，細胞間隙增寬，出現形態各異的KP。內皮炎時角膜各層均發生變化。經過治療后角膜上皮細胞可恢復正常，上皮下神經纖維叢密度仍較低，基質層朗格漢斯細胞密度下降但仍比健眼高，仍表現為樹突樣，角膜基質細胞腫脹減輕，炎癥細胞減少，內皮細胞形態逐漸恢復正常，KP吸收后內皮細胞覆蓋原來缺損區域[20-22]。Hillenaar等[23]也觀察到類似表現，其還發現經過1～3wk的治療，內皮細胞腫脹、邊界不清、炎癥細胞浸潤等體征均可以消失，但是內皮細胞數卻每年都在下降，以每年10.3%的速度在下降，內皮細胞發生了不可逆的反應。

跟裂隙燈的40倍的分辨率比起來，IVCM的500倍的分辨率可以觀察到裂隙燈無法觀察到的細胞形態改變，比如細胞間間隙擴大，內皮層炎癥細胞浸潤，細胞邊界不清，點狀空洞，內皮缺失等，其可以早期發現疾病，通過細胞水平的觀察，為臨床探討，治療及轉歸提供形態學依據，觀察治療效果，通過檢測形態學改變，把握臨床治療時間。共焦顯微鏡檢查對于HSK的診斷無特異性，在臨床上僅作輔助檢查。

3.4環媒恒溫擴增法環媒恒溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)由Notomi于2000年研發，是一種新式的恒溫核酸擴增方法，與病毒培養相比，LAMP的敏感性較高；與RT-PCR相比，LAMP的敏感性較低。

3.5間接免疫熒光法間接免疫熒光法(indirect immuno fluorescent technique，IIF)是組織化學和免疫學方法結合而成的一種比較靈敏的檢測方法， 主要借助顯微鏡檢查來觀察抗原-抗體反應。國內外均有學者利用此技術檢測出病毒性角膜炎中的病毒，Kaufman等[24]利用IIF與病毒分離兩種方法來檢測病毒性角膜炎患者中的病毒，檢測結果相符，證明了IIF檢測病毒的可行性。王怡等[25]利用間接免疫熒光技術在角膜內皮炎的患者房水及小梁組織中檢測出了HSV-1病毒。

3.6 PCR、RT-PCR、巢式PCR、多重PCRPCR是基于DNA的復制原理在體外對病毒DNA進行擴增，通過技術改進，又產生了RT-PCR、巢式PCR、多重PCR。多重PCR可早期、快速檢測出多種病原體，敏感性高，其最小檢出量為100fg DNA，相當于幾十個拷貝的HSV或十幾個真菌。但是多重PCR設計引物較困難，目前運用最廣泛的病原學檢測技術是RT-PCR，張愛雪等[26]證明了RT-PCR技術的高敏感性、高特異性和高精確性，其在疾病診斷、預后監測等方面有著廣泛的應用前景。Inoue 等[27]利用實時PCR在角膜內皮炎中檢測出HSV、CMV、VZV、HHV-7及HHV-8。其還利用RT-PCR檢測出了在治療前和治療后的HSK病毒DNA拷貝數的變化由此發現治療是否有效，而且還發現了阿昔洛韋耐藥病毒株。因此在臨床上運用抗病毒藥物無效時可用此法檢測，來判斷是否耐藥，從而及時更換治療方案。PCR檢查還對潛伏在角膜組織中的病毒的檢出具有較高的靈敏度[28]。

IIF、PCR及其改進技術用于病毒角膜內皮炎中檢測病毒具有高敏感性、高特異性，但是其設備昂貴、需要專業技術，價格較高，在臨床上運用具有一定限制性，故主要用于實驗室研究。目前對于病毒性角膜內皮炎的診斷還主要依靠臨床觀察。

4病毒性角膜內皮炎的治療

4.1臨床主要治療方法根據病毒性角膜內皮炎的發病機制，目前國內外較統一的觀點是抗病毒治療和糖皮質激素聯合運用，在臨床上，聯合用藥療效確切[18,28-30]。國內外專家均認為抗病毒為治療的第一要素，只有在足量抗病毒的前提下聯合應用適量激素才可迅速控制病情[31-32]。

抗病毒藥物中阿昔洛韋(acyclovir，ACV)是最早應用于臨床，抗病毒療效最好的藥物之一。而ACV對正常細胞毒性小，特異性高。目前，ACV仍為抗單純皰疹病毒首選藥物，靜脈滴注時常采用阿昔洛韋。伐昔洛韋是阿昔洛韋的前體物質，可在小腸迅速轉化為阿昔洛韋，生物利用度是后者的5倍，許多實驗也證明口服伐昔洛韋比口服阿昔洛韋安全性有效性更強[33]。故口服抗病毒藥物時常用伐昔洛韋。更昔洛韋(Ganciclovir，GCV)是ACV的一個同族體 ，出于安全性、有效性、耐受性考慮，0.15%更昔洛韋凝膠現在認為是局部抗病毒藥物的一線用藥，局部運用更昔洛韋凝膠或滴眼液在角膜和前房能達到有效治療劑量[34]。

關于病毒性角膜內皮炎治療中運用激素的問題，洪晶[35]認為中重度病毒性角膜內皮炎可局部使用糖皮質激素，重度盤狀型、彌漫型及所有線狀型需全身運用，在藥物治療過程中，研究發現對內皮炎患者延期應用糖皮質激素會加重角膜內皮細胞的丟失。因此，早期應用皮質類固醇激素可減少內皮細胞的丟失，及時控制病情發展。鄧世靖等[20]通過共聚焦顯微鏡觀察到角膜內皮炎時內皮細胞間有形態各異的炎癥細胞的聚集和浸潤，初發或病程較短的病例，基質層未見炎癥細胞浸潤，經及時治療，角膜可無明顯瘢痕形成；但反復發作，或病情遷延的患者，炎癥可波及角膜基質，至基質內出現多量炎癥細胞浸潤，可見瘢痕形成，臨床上表現為內皮型和基質型的混合類型。因此早期迅速控制炎癥至關重要。

史偉云[31]推薦阿昔洛韋靜脈滴注7～10d后改口服抗病毒藥3mo以上，局部抗病毒藥至少1mo，應逐漸減量至停藥，糖皮質激素在炎癥消退后應停藥，一般不超過4wk。洪晶等[29]則認為激素應使用1mo以上，線性角膜內皮炎激素類藥物使用時間不能少于3mo，但兩者均推薦在炎癥反應控制后還要使用一段時間的維持劑量藥物。Basak 等[36]推薦口服及局部抗病毒藥物1a或更長時間對預防復發是有用的。

4.2其他治療方法及研究現狀

4.2.1其他抗病毒藥物Brincidofovir(CMX001)是作為一種活躍的、親脂的西多福韋(CDV)形式發展而來的抗病毒藥物,以改善 CDV 的口服生物利用度在病毒感染的細中,CMX001 代謝釋放 CDV,抑制病毒 DNA 聚合酶,進而抑制病毒復制[37]。

4.2.2前房和玻璃體腔注射抗病毒藥物Choi等[38]成功利用前房GCV注射來治療嚴重CMV內皮炎的患者，第一個證明了GCV前房注射治療病毒性角膜內皮炎是可靠的、安全的。同時其發現GCV對角膜內皮細胞的毒性作用具有濃度依賴性，當GCV濃度大于5mg/mL時，細胞密度下降，抑制了細胞增殖，而當濃度小于0.5mg/mL則不會降低內皮細胞密度，是安全、可靠的。前房注射抗病毒藥物比全身用藥副作用較少，對于有嚴重藥物副作用的病毒性角膜內皮炎的患者，此方法也是一個很好的選擇。利用玻璃體腔注射也被證明能有效治療CMV角膜內皮炎的患者[39]。相對于玻璃體腔注射，前房注射可能更有優勢，其藥物可迅速抵達角膜內皮發揮作用。

4.2.3 基因治療在美國，每年有59萬的新發病例，其中25%～42%的患者初次發病1～2a間又復發。Young等[40]報道341初次感染HSV者1、5、10、20a復發率分別為27%、50%、57%、63%，有復發史者復發率則更高。HSK的復發除了因HSV-1的再活化外，還可能重新感染了新亞型HSV，Remeijer等[41]發現三分之一的復發疾病是角膜二次感染了HSV-1的新亞型，其中有63%的亞型是相同的。有HSK復發病史的血清陽性個體可能具有CC IL28B基因型。這種基因型可能與感染控制不完全以及三叉神經節第一神經支上周期性病毒脫落更為頻繁有關，臨床上表現為復發性皰疹性角膜炎。復發性HSV-1感染的臨床表現似乎受IL28B基因型多態性的影響[42]。此外HSV-1對治療藥物(多為阿昔洛韋)產生耐藥 也可能是引發HSV-1再次感染的原因之一。阿昔洛韋為抗病毒的一線藥物，而臨床及實驗室不斷發現對阿昔洛韋耐藥的病例[43]。患有HSK比患有HSV-1相關的其他疾病相比對ACV耐藥更高[44-45]，報告顯示，阿昔洛韋在角膜的耐藥性高達6%[46]，耐藥的病毒性角膜炎在其病毒潛伏期過后再次被激活時仍然耐藥[47]。全身抗病毒藥物耐藥性高，局部耐藥較全身用藥小，但局部用藥的眼表停留時間短，導致局部用藥效果差，Koganti 等[45]研究了一種新方法，將阿昔洛韋通過碳基藥物傳遞系統也就是藥物封裝碳(drug-encapsulated carbon，DECON)，可以增加局部阿昔洛韋的療效。DECON是一種無毒黏合劑。它裝載大量的藥物并運送到角結膜，以一種持續的方式附著在黏膜表面，使其成為傳統給藥的一種新選擇。

目前的治療藥物大多是作用在抑制病毒DNA聚合酶，對于耐藥的HSV感染，目前的抗病毒二線藥物有膦甲酸鈉和西多福韋，但藥物毒性大，臨床很少用。長期口服阿昔洛韋及類似物等可預防復發，但其并不能根除潛伏感染的病毒[48]。這就需要開發新藥，來阻止復發和耐藥，從而更好地預防和治療病毒性角膜內皮炎。

4.2.3.1疫苗我國朱明昭等[49]構建、制備Ⅰ型單純皰疹病毒糖蛋白D重組質粒DNA疫苗，免疫小鼠后，產生了特異性抗體，發現HSV-IgD重組質粒DNA有可能作為HSV-1的DNA疫苗。劉曉娟等[50]研究了白介素2(IL-2)cDNA協同HSV-1 gD核酸疫苗免疫對機體體液免疫和細胞免疫應答的影響，證明IL-2作為一種新型的免疫調節因子基因佐劑在抗HSV-1感染免疫中具有良好的應用前景。

Bettahi等[51]用自身輔助的糖蛋白D脂肽免疫小鼠，可以預防小鼠病毒性角膜炎的發生，接種疫苗的小鼠的淚液中病毒的滴度減少，但HSV-1 CD4 T細胞增殖和細胞因子卻增加了。Schrimpf等[52]通過敲除感染細胞蛋白(infected cell protein 8，ICP8)基因、病毒宿主關閉蛋白增強了疫苗的效能，降低角膜炎的發生率。在小鼠的試驗中學者證明了CJ83193可作為有效地防止HSV-1感染的疫苗[53]。Lu等[54]證明了 CJ9-gD可以讓UL9基因缺失，編碼額外的gD基因，感染后高表達gD，相對于CJ83193可以產生更多的抗HSV-1的特定中和抗體，防止野生型HSV-1病毒株感染，而且它免疫的小鼠產生更強的T細胞反應，阻止了80%的野生型病毒的潛伏感染。

4.2.3.2抗體2013年，Koganti等[45]開發了一種人源化單克隆抗體，命名為mAb hu2c，是一種病毒糖蛋白gB的抗體。mAb hu2c被證明能夠有效中和HSV-1的野生型和耐藥株，它阻斷了病毒在細胞間的傳播。

4.2.3.3解旋-引物酶抑制劑解旋-引物酶對于病毒復制是必不可少的，解旋-引物酶抑制劑是以包含了UL5、 UL8和 UL52的解旋-引物酶復合體為靶點，在動物模型上證實了其可有效控制病毒HSV感染[55]，這給病毒性角膜內皮炎的治療帶來希望。

4.2.3.4趨化因子受體傳統的藥物治療都是針對病毒酶的藥物，所有可用藥物控制的病毒蛋白和相關小分子不多，是有限的，而這些起直接作用的藥物的主要使用缺點是耐藥性的出現[56-57]。這就使人們去發展宿主導向分子[58]，Shimomura[1]通過在小鼠HSK模型上使用了8種趨化因子，發現這些趨化因子可以打開HSV的包膜，證明了其可以抑制HSV的感染。近年來基礎及藥物研究正在往病毒-宿主相互作用的網絡中的蛋白為靶點的方向發展，FDA批準了一個成功的抗病毒藥物是馬拉韋羅，是CCR5趨化因子受體，用來治療HIV感染[59]。相信近來比較熱門的VH protein-protein interactions (PPIs)的研究會對探索宿主導向藥物提供新方向。

4.2.3.5其它方法BX795是一種著名的PDK1抑制劑，其能抑制下游許多其他激酶包括TBK1、B激酶和IkB激酶(IKK)。與目前許多治療眼部HSV-1感染的方法不同，它不是核苷類似物。相反，BX795可以抑制Akt在Ser473位點的磷酸化并阻止其下游真核生物翻譯起始因子4e結合蛋白1的過磷酸化(4E-BP1)。Akt信號通路的激活隨后mTORC1的激活被證明可以增加病毒蛋白的合成，因此抑制該途徑是抑制細胞內病毒活動的有效途徑[45]。

目前基因治療還只是在動物模型上，分為以炎癥介質為靶點的基因治療和以病毒基因為靶點的基因治療，但在不久的將來相信在人的身上可以實現，更好地治療和預防病毒性角膜內皮炎。

5展望

對于病毒性角膜內皮炎發病機制，未來有望能更清楚地了解，實驗室病原學檢測技術的提高若能在臨床上廣泛推廣，則可避免延誤診斷，耐藥病毒株的出現及高復發率，急需研究新藥，基因工程藥物的研究目前尚處于實驗室研究階段，在不久的將來有望在臨床上推廣，從而給更多病毒性角膜內皮炎患者帶去曙光。