DH36鋼在需鈉弧菌、芽孢桿菌以及混菌腐蝕體系中的腐蝕行為

董碩，賀小燕，白秀琴，袁成清

（武漢理工大學 a.國家國家水運安全工程技術研究中心可靠性工程研究所b.船舶動力工程技術交通行業重點實驗室，武漢 430063）

海洋中孕育著復雜多樣的微生物，它們貼附于材料表面形成生物膜，通過改變材料表面的溶解氧濃度、離子濃度、pH值等直接或間接地影響材料的腐蝕發展，稱之為微生物腐蝕（Microbiologically Influenced Corrosion，簡稱MIC）。這是一種非常廣泛、嚴重的破壞因素，大約有 20%的腐蝕由 MIC引起[1]。MIC主要由細菌類與少量的真菌類微生物引起[2-3]，腐蝕性細菌按照生長過程中對氧的需求，分為嗜氧與厭氧兩大類，嗜氧腐蝕性細菌主要包括鐵氧化菌（IOB）、硫氧化菌（SOB）等，厭氧性細菌主要包括硫酸還原菌（SRB）、鐵還原菌（IRB）、硝酸鹽還原菌（NRB）等[4]，其中SRB是腐蝕破壞最普遍的菌種，在深海條件下仍能加速材料腐蝕[5]。浸海材料不同，這些細菌的腐蝕作用會有差異[6]。

在以往的微生物腐蝕研究中，多以研究單類細菌腐蝕為主。然而，浸海材料實際面臨的細菌腐蝕破壞是多菌種共同作用下的腐蝕結果，與單一菌種腐蝕環境相比，多菌種混合產生的腐蝕環境更加復雜，彼此的新陳代謝活動會影響菌種的生長，改變腐蝕的后續發展過程[7-11]。因此，多菌種混合的協同或者拮抗作用需要得到更多的重視。目前，多菌種引發腐蝕問題的研究主要集中在兩種組合體系：（1）厭氧菌與好氧菌的組合，如鐵氧化菌或硫氧化菌與硫酸鹽還原菌混菌體系的腐蝕問題；（2）好氧菌的組合，如鐵氧化菌與硫氧化菌混菌體系的腐蝕問題。對于自然界而言，兼性厭氧細菌是一類適應范圍極廣的細菌，它們在有氧或無氧環境均能引發腐蝕問題，且引發的腐蝕問題更加復雜。然而，對于兼性厭氧細菌混菌體系的腐蝕問題，目前還沒研究。需鈉弧菌與芽孢桿菌是典型的兼性厭氧細菌，分別為革蘭氏陰性菌與陽性菌，均是海洋環境中大量存在的典型菌種，本研究選取這兩種細菌，探討需鈉弧菌、芽孢桿菌單獨培養以及混合存在時對DH36鋼的腐蝕行為影響，旨為海洋微生物防腐提供依據。

1 實驗

1.1 試樣制備

實驗選用的材料為海洋工程鋼DH36，其元素比例（質量分數）為：C≤18%，Mn 9%～16%，Si≤5%，V≤3.5%，S≤3.5%，P≤3.5%。與普通碳鋼相比，DH36的 Mn元素含量較高。DH36圓形試樣的直徑為10 mm，厚度為4 mm，將試樣工作面分別用240#、400#、600#、1000#、1200#號砂紙進行打磨后拋光。所有試樣均用去離子水清洗，之后使用酒精浸泡吸水，取出后放入干燥器中干燥保存。實驗所用工作電極只暴露出工作面，使用導電膠將銅線固定在試樣背面，而后在導電膠上繼續涂裝環氧樹脂，使環氧樹脂包裹圓柱形試樣的背面與側面，為保證密封性，在工作面的邊緣與環氧樹脂交界處，使用704硅膠二次封裝。試樣在浸泡菌液之前，需要先放置在紫外燈下滅菌30 min，以保證試樣沒有微生物殘留。

1.2 細菌培養與腐蝕浸泡

需鈉弧菌（菌種編號：MCCC1A04243）與芽孢桿菌（菌種編號：MCCC1A00791）菌株均來源于中國海洋微生物菌種保藏管理中心。培養基類型均為2216E培養基，其成分為：魚粉蛋白胨5 g，酵母浸粉1 g，人工海水1 L。加入營養成分之后，需要用NaOH溶液將培養基的pH值調節至7.4～7.6之間，而后將培養基放置在 121 ℃條件下的高溫滅菌鍋內，滅菌20～25 min，取出后放在無菌工作臺內自然冷卻至室溫。實驗所用細菌為平板上挑選的單個細菌菌落。

選用廣口藍蓋瓶作為細菌的活化容器，搖床轉速設置為120 r/min，溫度設置為30 ℃，使細菌增殖至對數生長期。掛樣腐蝕的容器為50 mL錐形瓶，將處于對數生長期的細菌接種至錐形瓶，菌液與液體培養基的體積比控制為1∶50左右，混菌培養時，接種細菌量各占一半。將封裝好、滅菌后的試樣穿透瓶塞懸掛至錐形瓶內，銅線與瓶塞的縫隙用脫脂棉堵好，起到固定銅線與避免外部雜菌進入的作用，所有與細菌有關的操作均在凈化工作臺中進行，培養基換液時間間隔為2 d。

1.3 SEM觀察

將浸泡在菌液中的試樣取出后，先用體積分數為2.5%的戊二醛溶液浸泡試樣2 h，再用蒸餾水浸泡15 min去除鹽結晶，隨后分別用體積分數為 25%、50%、75%、90%的乙醇溶液浸泡5 min，最后用體積分數為100%的乙醇浸泡試樣兩次，每次10 min，放于干燥箱干燥后保存。將處理好的樣品進行掃描電子電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察，得到微生物的形態、分布狀況以及銹層形貌。

1.4 表面分析

將浸泡在菌液中的試樣取出后，采用衰減全反射紅外傅里葉光譜儀（Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy，簡稱為ATR-FTIR）測試分析腐蝕產物的元素比，設置掃描范圍為4000～500 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數為128次，得出浸泡第7 d時樣品表面的有機物官能團信息。

1.5 電化學測試

實驗使用CS310H電化學工作站，選用三電極體系，參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為表面積為1 cm2的鉑電極，封裝好的試樣為工作電極。電化學阻抗譜測試是在自腐蝕電位下進行，電極等待“穩定”時間為30 min，激勵信號為10 mV正弦波，頻率范圍為10 Hz～100 kHz，阻抗譜數據使用Zsimpwin軟件擬合。采用動電位掃描法，極化曲線測試范圍為相對開路電位±400 mV，掃描速率0.5 mV/s。

2 結果與討論

2.1 細菌生長狀況分析

圖1為兩種細菌單獨培養時的生長曲線與培養基pH值走勢圖。由圖1可以看出，兩種細菌的生長遲滯期均不明顯，只存在幾小時，在前期營養物質供給充足的條件下，細菌迅速進入對數生長期，OD值走勢表現出接近垂直增長的現象。需鈉弧菌是細菌中生長最迅速的一類菌種，每9.8 min就可以完成一次分裂增殖[12]。相比于芽孢桿菌，需鈉弧菌對數期增長更快，在培養第1 d時，OD值達到最大，之后進入生長的穩定期，穩定期大約維持2～3 d后，培養基的營養物質被大量消耗，難以維持需鈉弧菌繼續增長，OD值開始出現下降。芽孢桿菌菌液OD值達到最大的時間點，要比需鈉弧菌延遲十幾個小時，這與菌液pH值的趨勢表現一致，其菌液pH值大概在第2 d時降到最低值6.1，隨后逐漸增加到7.2，需鈉弧菌產生的酸類物質較少，pH值最低值為6.6，芽孢桿菌生長穩定期大致在1.5～4.5 d之間，由于代謝相對緩慢，培養基提供的營養物質消耗較少，穩定期的時間變得更長。

2.2 腐蝕形貌觀察

DH36鋼在不同腐蝕體系中浸泡7 d后的腐蝕形貌及傅里葉變換紅外光譜圖如圖2所示。需鈉弧菌腐蝕體系中，生物膜與銹層摻雜形成的混合層并不致密，存在明顯的裂痕，這些裂痕可作為外界腐蝕介質的通路，接觸銹層下的基體材料。芽孢桿菌腐蝕體系中，芽孢桿菌在試樣表面的附著量較大，不僅存在于銹層外圍，與銹層結構相互粘連，甚至被銹層包裹，說明芽孢桿菌產生的生物膜已經覆蓋并滲透于銹層之中。浸泡7 d后，雖然鐵銹充斥于培養基中，但定期換液使得芽孢桿菌依然保持著較高的代謝活性，其在試樣的吸附行為沒有減弱的趨勢，生物膜持續增多。混菌腐蝕體系中，浸泡7 d后，試樣表面出現大量的細菌，可以看出芽孢桿菌形態與單芽孢桿菌培養時不同，尺寸較小，形態為圓球形，生存狀態不佳，這是由于混菌培養后期，需鈉弧菌對溶解氧與營養物質的消耗抑制了芽孢桿菌的生存狀態，不僅使兩者生物膜的成形更慢，也使芽孢桿菌沒有很好的生長。混合層之間的粘連性很差，松散的菌體與腐蝕產物在裂開的混合層之間結合。

傅里葉變換紅外光譜圖顯示，三種腐蝕體系有相似的吸收峰波長，吸收峰強度有差異，3370.23 cm-1附近的吸收峰由—OH鍵或 N—H伸縮振動引起，2888.05 cm-1附近的吸收峰由C—H伸縮振動引起，1645.95 cm-1附近的吸收峰由C==O伸縮振動引起，1407.14 cm-1附近的吸收峰與羧酸官能團有關，1128.76 cm-1附近的吸收峰與C—O—C或P==O有關，875.42 cm-1附近的吸收峰可能與==C—H有關，這些吸收峰由多糖等有機物引起。紅外譜圖表明，在三種腐蝕體系中，細菌均在樣品表面吸附，形成生物膜。

DH36鋼在不同腐蝕體系中浸泡7 d后的EDS元素分析結果見表1。C、P、S元素是生物膜中大量含有的元素，在浸泡7 d后占據接近20%的比例，表明銹層中充斥著大量的微生物。芽孢桿菌腐蝕體系中出現了Mg元素，這可能是貼附在試樣表面的鹽結晶在脫水過程中未被溶解去除。Fe、O元素占據絕大比例，說明試樣表面成分仍主要由鐵的氧化物組成。

2.3 開路電位

圖3為三種腐蝕體系中開路電位隨浸泡時間的變化曲線。由圖3可知，浸泡1 d內的開路電位均大幅度下降，之后逐漸減小直至穩定。需鈉弧菌新陳代謝可以分泌腐蝕性產物，惡化腐蝕環境；另一方面，浸泡前期培養基中的溶解氧可以快速地到達基體表面，試樣腐蝕快速進行，所以導致前期開路電位下降，腐蝕傾向增大。隨著生物膜的貼附與銹層的逐漸堆積，開路電位表現出逐漸穩定的趨勢。芽孢桿菌腐蝕體系中，試樣開路電位在浸泡3～5 d內下降較快，這與需鈉弧菌中的走勢有些差異。5 d后開路電位趨于穩定，此時芽孢桿菌菌體在試樣表面大量貼附，生物膜、銹層構成的混合層較為致密，阻隔了溶解氧向材料基體的擴散，腐蝕傾向減緩。混菌腐蝕體系中的開路電位數值為所有腐蝕體系中最負，在浸泡初期迅速下降，而后很快保持穩定，在-0.78 V處上下些許震蕩，試樣的腐蝕傾向在所有腐蝕體系中最高。

2.4 交流阻抗

圖4為DH36鋼浸泡不同腐蝕體系中第1、3、7 d時的電化學阻抗譜。如圖4a、d、g所示，浸泡第1 d時，不同腐蝕體系中的Nyquist低頻處均出現了感抗特征。目前普遍認為，低頻感抗可能由以下幾種因素導致：（1）電極表面的Clads-與Hads+引起的弛豫現象[13]；（2）試樣表面有某些抑制劑貼附[13]；（3）細菌吸附、脫附的反復過程以及生物膜的逐漸形成[14]；（4）點蝕處于誘導期[15]，點蝕穩定發生后，低頻的感抗行為便會消失。實驗中的感抗特征可能與（3）、（4）相關。浸泡前3 d，單菌種腐蝕體系中的低頻阻抗弧半徑均表現為逐漸減小，不同之處在于浸泡3 d后，芽孢桿菌腐蝕體系中的阻抗弧半徑顯著增大，腐蝕速率降低。混菌腐蝕體系中阻抗弧半徑的變化趨勢與需鈉弧菌腐蝕體系類似，半徑持續減小，腐蝕速率持續增大。圖4c、f、i反映出兩個時間常數，低頻對應DH36鋼基體界面的雙電容層，高頻對應DH36鋼表面的銹層與生物膜膜層結構，浸泡后期沒有出現 3個時間常數，說明生物膜與銹層滲透在了一起，這與腐蝕形貌圖結果保持一致，沒有產生明顯的分層行為，在等效電路中可被表示為一個電路元件。

為了更好地理解 DH36鋼腐蝕過程中的阻抗特性，使用Zsimpwin軟件對阻抗譜進行擬合。試樣表面在被腐蝕之后很粗糙，因其引起的擴散作用，以常相角元件Q代替理想電容C，擬合等效電路類型取R(Q((LR)(QR)))與R(Q(R(QR)))，等效電路圖見圖5，Rs表示溶液電阻，Qbc表示生物膜與銹層混合層電容，Rbc表示生物膜與銹層混合層電阻，L表示電感，Qdl表示雙電層電容，Rct表示電荷轉移電阻，擬合參數見表2。

表2 等效電路圖擬合參數值Tab.2 Parameter values of elements in the equivalent circuit models

需鈉弧菌腐蝕體系中，Rct處于一直緩慢下降的狀態，由第 1 d 的 1583 Ω·cm2降至第 7 d 的 1110 Ω·cm2，說明試樣的腐蝕阻力隨著浸泡時間的增長而逐漸減小，對應的腐蝕速度逐漸變大。Y(Qbc)在1～7 d內逐漸增大，說明細菌在此期間更傾向于在試樣表面貼附，生物膜正在試樣表面形成。隨著生物膜的逐漸形成，膜層的阻抗值卻沒有一直增大，原因在于第7 d生物膜與銹層雜合形成的混合層的致密性較差，膜層的阻抗值略微減小，腐蝕性物質可以更容易地從膜層的裂縫處向基體表面靠近，使試樣的腐蝕速度增加。芽孢桿菌腐蝕體系中，浸泡3 d后，Rct的變化趨勢與需鈉弧菌腐蝕體系中的相反，Rct表現出增大趨勢，第7 d時增大到1431 Ω·cm2，為腐蝕周期內最高，這可能與試樣表面越來越致密的阻隔層有關。從Y(Qbc)變化趨勢可以看出，浸泡期間細菌處于不斷吸附試樣表面的狀態，生物膜逐漸增多、增厚，n(Qbc)呈現一直增加的規律，浸泡7 d時，n(Qbc)達到0.921，此時的生物膜與銹層形成的混合層在試樣表面均勻覆蓋，混合層的等效常相角元件性質接近電容特性，膜層的阻抗值由第 1 d的 44.3 Ω·cm2一直增大到第 7 d的212.7 Ω·cm2，表明混合層在覆蓋比較均勻的同時，其堆積方式也很致密，隨著浸泡時間的延長，其阻隔作用越來越明顯，腐蝕速率開始減緩。混菌腐蝕體系中，非常明顯的特征是Rct下降幅度較大，由浸泡第 1 d的 1479 Ω·cm2降低至第 7 d 的 633 Ω·cm2，混菌體系下電荷轉移反應顯著加快，表明在混菌培養基中，試樣的腐蝕速度不斷增加，浸泡后期的電荷轉移電阻大小不到初期的一半，混菌促進腐蝕的效果明顯。n(Qbc)在浸泡后期有所降低，說明混合膜層的均一性較差，在整個浸泡期間，混合層的阻抗值較小，膜層對試樣基體的保護性很差，這可能是由于膜層較為疏松，局部出現破裂產生裂痕，導致Rbc、Rct的變化趨勢與需鈉弧菌腐蝕體系中相似。

2.5 極化曲線

圖6是DH36鋼在需鈉弧菌、芽孢桿菌以及混菌腐蝕體系中浸泡7 d時的極化曲線。DH36鋼的耐蝕性很差，浸泡第7 d時，極化曲線陽極部分的斜率仍然較小，沒有出現鈍化行為，腐蝕速率由陰極氧擴散控制。與芽孢桿菌腐蝕體系相比，需鈉弧菌腐蝕體系中的極化曲線向右下方移動，表明其自腐蝕電位更低，腐蝕電流更大，混菌腐蝕體系中的自腐蝕電位居于單菌種腐蝕體系之間，腐蝕電流最大。通過 Tafel外推法，得到了試樣在不同腐蝕體系中浸泡第7 d時的極化曲線參數擬合值，見表3，此時需鈉弧菌、芽孢桿菌、混菌腐蝕體系中的腐蝕電流值分別為9.85、5.87、13.53 μA/cm2。

圖7為DH36鋼在不同腐蝕體系中浸泡1、3、7 d后的腐蝕電流值。需鈉弧菌腐蝕體系中的腐蝕電流持續增大，腐蝕速率不斷加快，芽孢桿菌腐蝕體系中的腐蝕電流呈現先增大后減小的趨勢，浸泡第7 d時，腐蝕電流值顯著降低，說明隨著浸泡時間的延長，芽孢桿菌逐漸體現出抑制腐蝕的作用。第3、7 d時，混菌腐蝕體系中的腐蝕電流在三種腐蝕體系中最大，表明浸泡3 d后，混菌腐蝕體系中的腐蝕速度始終最大，混菌共存時加快了試樣腐蝕，第7 d時表現最明顯。

在浸泡前3 d，單菌種腐蝕體系中試樣的腐蝕電流變化類似，均呈現增大趨勢，且數值上比較接近，說明在此浸泡時間內，兩種條件中的試樣表面狀態比較接近，生物膜均沒有成型，還沒有對腐蝕產生主導影響，腐蝕性代謝產物是促進腐蝕的主要原因。浸泡3 d后，微生物的生存特性體現出來，芽孢桿菌在實驗后期具有比較好的生長活性，易于在試樣表面貼附，可以較快地形成生物膜，阻隔層不但減緩Fe2+從基體脫離后向溶液的擴散，還阻隔了溶解氧參與陰極反應，腐蝕速率減緩，同時芽孢桿菌屬細菌代謝出的緩蝕性物質可能是導致腐蝕變慢的一個重要原因[16]，而需鈉弧菌生物膜與鐵氧銹層混合的膜層裂痕較多，局部的氧濃差電池加快了腐蝕速度，腐蝕電流持續增大。浸泡3 d后，混菌腐蝕體系中試樣的腐蝕電流為所有腐蝕體系中最大，在浸泡期間內一直增加。兩種細菌的代謝活動消耗了大量的溶解氧，創造出缺氧環境，需鈉弧菌是兼性厭氧細菌，對缺氧環境的適應性優于芽孢桿菌，在浸泡后期，芽孢桿菌的生長受到抑制，在SEM圖中可以看出芽孢桿菌產生出了芽孢，以抵御不良環境的影響，稀薄的生物膜也影響了銹層的堆積結構，使得混合層的致密性在有菌腐蝕條件中表現最差，試樣的腐蝕傾向最大。混菌腐蝕體系中試樣的腐蝕行為整體與需鈉弧菌腐蝕體系類似，均為持續促進腐蝕發生。

表3 DH36鋼在不同腐蝕體系中浸泡7 d時的極化曲線參數擬合值Tab.3 Fitting parameter values of potentiodynamic polarization curves of DH36 steel after 7 d of immersion in different corrosion systems

3 結論

1）需鈉弧菌持續促進 DH36試樣的腐蝕速度，浸泡前3 d的促進作用較為明顯，浸泡3 d后腐蝕速度增長較慢，維持在一個較高的數值。前期腐蝕加快是腐蝕性代謝產物的影響，后期混合層的致密性下降，阻隔溶解氧的作用減弱，腐蝕速度持續增大。

2）浸泡前3 d，芽孢桿菌腐蝕體系中試樣的電荷轉移電阻降低，腐蝕電流增大。第7 d時，試樣表面形成的混合層比較致密厚實，第7 d的電荷轉移電阻與阻隔層阻抗值達到最大，腐蝕速度顯著下降。浸泡后期，芽孢桿菌顯示出抑制DH36鋼腐蝕的作用。

3）混菌腐蝕體系中，兩種細菌對培養基中的營養物質以及溶解氧進行競爭，芽孢桿菌的生長狀態被抑制，生出芽孢以抵御不良環境的影響。生物膜最終影響了銹層的堆積狀態，混合層的粘連性很差，松散菌體與腐蝕產物在裂開的混合層之間結合，局部氧濃差電池的產生加快了腐蝕的進行。

4）混菌腐蝕體系中，試樣的腐蝕電流呈現一直增加的趨勢，浸泡3 d后為所有腐蝕體系中最大，試樣的腐蝕發展狀況更接近于需鈉弧菌腐蝕體系，但腐蝕結果更嚴重。