杜仲抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌的抑菌作用及機制研究△

趙丹，張湘燕，羅振華，董旋，趙德剛*

1.貴州省人民醫院 呼吸與危重癥醫學科/貴州省呼吸疾病研究所，貴州 貴陽 550002；2.肺臟免疫性疾病診治國家衛健委重點實驗室，貴州 貴陽 550002；3.貴州省人民醫院 中心實驗室，貴州 貴陽 550002；4.貴州大學 生物工程研究院/貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550002

杜仲為杜仲科杜仲屬植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，味甘、微辛，性溫，可以降壓，利尿，緩解頭暈、失眠等癥狀，對各種細菌、真菌具有抑制作用，但具體機制尚不明確。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，又稱抗微生物肽或肽抗生素，是一類小分子的多肽類物質，一般由10～60個氨基酸殘基組成，相對分子質量在3000～6000[1]。抗菌肽廣泛分布于動物、植物等生物體內，構成了機體防御病原體快速而高效的屏障。本課題組前期研究證實，轉杜仲幾丁質酶基因EuCHIT1的番茄可提高對灰霉病的抗性[2]。因此，推斷多肽EuCHIT1是杜仲中的抗菌肽之一。本研究在前期工作的基礎上，利用原核表達、鎳親和色譜法純化得到抗菌肽EuCHIT1，體外檢測其對白色念珠菌的抑菌作用，并探討其抑菌機制，為其進一步的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 菌株及細胞

白色念珠菌CanidiaalbicansATCC 10231，由貴州省人民醫院中心實驗室羅振華主任惠贈；SD大鼠肺組織WTRL1細胞購于美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞庫。

1.2 試藥

沙堡氏(4%)葡萄糖瓊脂培養基(廣州市齊云生物技術有限公司)；氟康唑注射液(批號：2003070512)由辰星藥業有限公司生產；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)購自上海仁捷生物科技有限公司；細胞膜熒光探針DiSC3(5)購自美國AAT Bioquest Inc公司；Triton X-100購自北京雷根生物公司；白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器

F-380型熒光分光光度計(天津港東科技股份有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(美國賽默飛公司)。

2 方法

2.1 菌株培養及多肽制備

白色念珠菌接種于沙堡氏(4%)葡萄糖瓊脂培養基，28 ℃培養36 h后用于實驗。參照本課題組前期實驗方法[3]，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增EuCHIT1蛋白的編碼區，構建原核表達質粒并轉化到大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)，經異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，采用鎳親和色譜法純化得到可溶性的抗菌肽EuCHIT1。將其溶解在無菌注射液用水中，置于-20 ℃保存。

2.2 抑菌圈檢測

采用二倍最小抑菌濃度(MIC)法，配制質量濃度分別為32、64、128、256、512 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液，各取10 μL依次點在含有細菌的培養基上。對照組加入等體積滅菌注射用水，陽性對照組加入注射用氟康唑(8 μg·mL-1，臨床治療中可達到的藥物濃度)[4]，28 ℃培養24 h。培養后取出培養基，用鋼尺測量每個培養基上的抑菌圈直徑。實驗重復3次，取平均值。

2.3 細胞膜去極化作用測定

取對數生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為10 cm)，收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，重懸菌液至吸光度(A)值為0.05。分別加入2.2項下5種質量濃度EuCHIT1溶液100 μL，以滅菌注射用水作為對照，注射用氟康唑(8 μg·mL-1)作為陽性對照，28 ℃處理60 min后向每組中加入終濃度為0.4 μmol·L-1的DiSC3(5)，室溫振蕩避光孵育15～30 min，取2 mL細菌懸浮液于石英比色皿中，利用熒光分光光度計，在激發波長為622 nm、發射波長為670 nm條件下測定熒光強度[5]。實驗重復3次。

2.4 細胞膜通透性測定

取對數生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為10 cm)，收集菌體，PBS洗滌3次后，重懸菌液至A值為0.05。加入質量濃度為32 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液100 μL，以滅菌注射用水作為對照，0.2% Triton X-100作為陽性對照，28 ℃處理60 min后向每組中加入1.5 mmol·mL-1的ONPG溶液100 μL，37 ℃孵育60 min后每間隔10 min于酶標儀測定420 nm 處A值[6]。實驗重復3次。

2.5 (1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量測定

取對數生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為10 cm)，收集菌體，PBS洗滌3次后，重懸菌液至A值為0.05。加入質量濃度為32 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液100 μL，以滅菌注射用水作為對照，以注射用氟康唑(8 μg·mL-1)作為陽性對照，室溫振蕩孵育15～30 min。通過鱟試驗動態濁度法測定白色念珠菌中(1，3)-β-D-葡聚糖含量[7]；高效液相色譜法檢測麥角甾醇含量[8]。實驗重復3次。

2.6 IL-1β、IL-6、TNF-α測定

取對數生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min，收集菌體，PBS洗滌3次后，重懸菌液至A值為0.05。在WTRL1細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于含5%CO2的37 ℃培養箱中培養。取對數生長期WTRL1細胞，在96孔板內加入密度為1×105個/mL的WTRL1細胞，每孔100 μL，細胞貼壁后，每孔加入32 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液100 μL，終質量濃度為16 μg·mL-1。以滅菌注射用水作為對照，以注射用氟康唑(8 μg·mL-1)作為陽性對照。5%CO2細胞培養箱36 ℃培養180 min后，裂解液裂解細胞，按ELISA試劑盒步驟，于酶標儀420 nm處測定A值，計算IL-1β、IL-6、TNF-α含量。實驗重復3次。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 抗菌肽EuCHIT1的原核表達與純化

原核表達、鎳親和色譜法純化得到多肽EuCHIT1，采用Bradford法定量，純度約80%，收率約0.7 mg·L-1，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)定性圖譜顯示EuCHIT1總相對分子質量為77 210。

3.2 抑菌圈測定

結果顯示，隨著抗菌肽EuCHIT1質量濃度的增加，對白色念珠菌的抑菌圈寬度逐漸增大，EuCHIT1 32、64、128、256、512 μg·mL-1對白色念珠菌的抑菌圈直徑分別為12.0、16.5、18.0、22.0、25.0 mm。陰性對照滅菌注射用水抑菌圈直徑為0 mm，陽性對照氟康唑抑菌圈直徑為25 mm。

3.3 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌細胞膜的去極化作用

與對照組比較，陽性對照氟康唑對細胞膜去極化作用增強；隨著EuCHIT1質量濃度的增加，其對細胞膜的去極化作用逐漸增強(P<0.05)，見表1。

表1 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌細胞膜的去極化作用

3.4 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌細胞膜通透性影響

與對照組比較，隨著抗菌肽EuCHIT1與白色念珠菌菌液作用時間延長，細菌細胞膜通透性逐漸增加，P<0.05。至60 min時，細胞膜通透性與陽性對照0.2% Triton X-100組比較無統計學差異。結果見表2。

表2 不同濃度EuCHIT1對白色念珠菌細胞膜通透性的影響

3.5 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量的影響

與對照組比較，抗菌肽EuCHIT1 32 μg·mL-1可顯著降低白色念珠菌中(1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量(P<0.05)，作用與氟康唑8 μg·mL-1相當(見表3)。

表3 EuCHIT1對白色念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量的影響

3.6 抗菌肽EuCHIT1對感染白色念珠菌的WTRL1細胞中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的影響

與模型組比較，抗菌肽EuCHIT1 16 μg·mL-1可顯著降低WTRL1細胞IL-6及TNF-α水平(P<0.05)，作用與氟康唑8 μg·mL-1相當，與對照組比較差異無統計學意義(見表4)。

表4 EuCHIT1對感染白色念珠菌的WTRL1細胞中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的影響

4 討論

侵襲性真菌感染是臨床常見的感染性疾病之一，但是由于廣譜抗真菌藥物的濫用，導致臨床中真菌耐藥狀況日益加重[9-10]。因此，需要尋找適合臨床使用的新的抗真菌藥物。抗菌肽廣泛存在于動物、植物等生物體中，是宿主對抗外界病原微生物感染而產生的一系列免疫應答反應產物，研究表明，抗菌肽在感染性疾病的治療中具有重要的應用價值[11-12]。杜仲含有木脂素類、環烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖類等成分及多種抗真菌蛋白[13-15]。由于抗菌肽具有廣譜抗菌、抗被膜病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤等作用，且不破壞人體正常細胞、不易產生耐藥性。因此，抗菌肽在臨床醫學、食品加工、日化、農業及飼料添加劑和動物藥品等領域具有廣闊的開發應用前景[16]。

本研究在前期實驗的基礎上，在杜仲中純化得到可溶性的抗菌肽EuCHIT1。在抑菌實驗中，隨著抗菌肽EuCHIT1質量濃度升高，抑菌效果增強，表明抗菌肽EuCHIT的抗真菌作用具有明顯的量效關系。目前研究表明[17]，動植物來源的抗菌肽能起到有效的抗真菌作用，其機制可能是抗菌肽可以誘導白色念珠菌胞內活性氧(ROS)積聚、線粒體膜電位去極化，進而引起白色念珠菌線粒體氧化損傷，而線粒體氧化損傷可能與白色念珠菌細胞的凋亡與壞死相關。抗菌肽EuCHIT1可導致白色念珠菌細胞膜的去極化及通透性增加，從而起到抗真菌作用。抗菌肽的抗菌機制主要是在細菌質膜上形成離子通道，破壞膜勢，引起胞內物質外泄；同時可與膜吸附結合、破壞外膜滲透性，從而導致細菌死亡的研究結果相似[18-19]。(1-3)-β-D-葡聚糖作為真菌細胞壁成分之一，其結構和功能破壞可導致胞內物質泄漏，生理代謝受阻等，進而致菌體死亡。因此，(1，3)-β-D-葡聚糖含量已被用作檢測是否存在深部真菌感染的指標[20]。麥角甾醇是酵母細胞中的主要甾醇，主要在內質網(ER)和脂滴中合成，作為各種膜的基本組成成分，其減少改變了白色念珠菌正常細胞膜的特性[21]。文獻報道，苦參堿可通過抑制白色念珠菌細胞膜上真菌甾醇合成過程中的一個關鍵酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的活性，影響麥角固醇生物合成而發揮其抗真菌活性[8]。本研究表明，抗菌肽EuCHIT1可降低白色念珠菌(1-3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量，作用與氟康唑8 μg·mL-1相當。

白色念珠菌感染可導致機體炎性反應，IL-1β、IL-6及TNF-α水平能夠反映機體的炎性程度。研究表明，氟康唑膠囊可降低患者真菌性外耳道炎的血清中IL-6、C-反應蛋白(CRP)和TNF-α水平[22]。本研究結果提示，抗菌肽EuCHIT1能降低感染了白色念珠菌的SD大鼠WTRL1細胞中IL-6及TNF-α水平，其與氟康唑在抗真菌感染時能有效改善炎性因子水平結果相似。

綜上，抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌具有抑菌作用，由于抗菌肽與傳統的抗生素相比，其抗菌機制不同，細菌難以對其產生耐藥性，有望成為新一代綠色環保的抗真菌新藥，具有較好的臨床應用前景，但其臨床應用療效和具體抑菌機制尚需進一步研究明確。