復方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜建立△

應珂，王建方，查慧軍，鄭亞純，金漢臺，姚建標*

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司/浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江 杭州 310052；2.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400

復方魚腥草合劑是由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花經提取、濃縮、醇沉、配制等步驟制備而成，具有清熱解毒的功效，用于外感風熱所致的急喉痹、急乳蛾，癥見咽部紅腫、咽痛；急性咽炎、急性扁桃體炎見上述證候者[1]。現代臨床研究表明，復方魚腥草合劑可用于小兒急性上呼吸道感染[2-3]、手足口病[4-5]、流行性腮腺炎[6]、兒童皰疹性咽峽炎[7]等疾病的治療。

復方魚腥草合劑的執行標準是國家食品藥品監督管理局頒布的國家藥品標準[WS-10821(ZD-0821)-2002-2012Z]，其中檢驗內容主要包括對魚腥草、黃芩的薄層鑒別項，相對密度、pH等檢查項，黃芩苷含量測定項，無法對制劑整體質量進行客觀評價，目前也沒有相關文獻報道相關方法。

本研究采用HPLC，根據《中國人民共和國藥典》2015年版通則[8]要求，進行多成分指紋圖譜研究，建立復方魚腥草合劑的指紋圖譜，并對主要的色譜峰進行歸屬性研究，采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.130723版)進行相似度評價，以此建立更全面可控的質量標準，以更有效地控制制劑整體質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20ADXR型高效液相色譜儀；Thermo UPLC-LTQ-Orbitrap型液質聯用儀；MSA225S-1CE-DU型電子天平(德國賽多利斯，d=0.01 mg，max=220 g)；Milli-QA10型純水儀(密里博中國有限公司)；LG10-2.4A型高速離心機(北京京立離心機有限公司)。

1.2 試藥

復方魚腥草合劑(批號分別為A180244、B180155、180207、B180222、A180105，浙江康恩貝中藥有限公司)；復方魚腥草合劑(批號分別為180308、180305、180122、180414、180125，浙江惠松制藥有限公司)；復方魚腥草合劑(批號分別為180500501、V171105、180100701、180403102、180502401，浙江國鏡藥業有限公司)；5-羥甲基糠醛對照品(批號：111626-201610)、苯甲酸鈉對照品(批號：100433-200301)、羥苯乙酯對照品(批號：100847-201604)、槲皮苷對照品(批號：111538-200504)、黃芩苷對照品(批號：110715-201318)、漢黃芩苷對照品(批號：112002-201702)、漢黃芩素對照品(批號：111514-201706)、連翹酯苷A對照品(批號：111810-201707)、連翹苷對照品(批號：110821-200508)、綠原酸對照品(批號：110753-201817)、魚腥草對照藥材(批號：121046-201607)、黃芩對照藥材(批號：120955-201810)、板藍根對照藥材(批號：121177-201608)、連翹對照藥材(批號：120908-201216)、金銀花對照藥材(批號：121060-201608)均由中國食品藥品檢定研究院提供；連翹酯苷E對照品(成都曼斯特科技有限公司，批號：DST180412-083)；隱綠原酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y12O8H45678)；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取本品，5000 r·min-1離心5 min(離心半徑為8.5 cm)，取上清液，即得。

2.2 單味藥溶液的制備

參照復方魚腥草合劑制備工藝，分別制備方中各單味藥材的單味藥制劑，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基糠醛、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、槲皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對照品適量，分別置量瓶中，加50%甲醇制成0.1 mg·mL-1的溶液，即得。

2.4 指紋圖譜參照峰

所建立的指紋圖譜中，黃芩苷所示峰具有最大的峰面積、適中的保留時間以及穩定的峰形，因此選擇此峰作為參照峰。在后續研究中，均以此峰作為參照，用來計算其余峰的相對峰面積及相對保留時間。

2.5 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Besil 5 C18-B 250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇作為流動相A，以0.1%磷酸溶液作為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，20%～30%A；15～40 min，30%～55%A；40～45 min，55%～65%A；45～50 min，65%～80%A；50～55 min，80%A)；檢測波長為210 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL，流速為1.0 mL·min-1。

2.6 UPLC-LTQ-Orbitrap分析條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Besil 5 C18-B 250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇作為流動相A，以0.1%甲酸溶液作為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，20%～30%A；15～40 min，30%～55%A；40～45 min，55%～65%A；45～50 min，65%～80%A；50～55 min，80%A)；檢測波長為210 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL，流速為1.0 mL·min-1。

電噴霧離子源(ESI)，負離子模式檢測，加熱溫度為350 ℃，鞘氣流速為12 L·min-1，輔助氣流速為3 L·min-1，吹掃氣流速為0 L·min-1，噴霧電壓為3.20 kV，離子傳輸管溫度為325 ℃。鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度≥99.99%)，碰撞氣為高純氦氣；采用傅里葉變換高分辨全掃描方式，質量掃描范圍m/z50～1200；多級質譜采用數據依賴式掃描，誘導碰撞解離(CID)模式，碰撞能為35 V。

2.7 方法學驗證

2.7.1精密度試驗 取復方魚腥草合劑(批號：A180244)樣品，根據2.1項下方法制備供試品溶液，使用2.5項下色譜條件連續進樣檢測6次，記錄色譜圖，以6針平均值為模板計算其相似度，結果各圖譜共有峰與對照指紋圖譜相似度均達1.000，表明本方法儀器精密度良好。

2.7.2重復性試驗 取復方魚腥草合劑(批號：A180244)樣品，根據2.1項下方法制備6份供試品溶液，使用2.5項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以6份平均值為模板計算其相似度，結果各圖譜共有峰的相似度均達0.999以上，表明本方法重復性良好。

2.7.3穩定性試驗 取復方魚腥草合劑(批號：A180244)樣品，根據2.1項下方法制備供試品溶液，分別于0、6、12、24 h使用2.5項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以不同時間點的平均值為模板計算其相似度，結果各圖譜共有峰的相似度均達1.000，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

2.8 對照指紋圖譜的建立

2.8.1對照模板及相似度 選取15批復方魚腥草合劑樣品，根據2.1項下方法分別制備供試品溶液，使用2.5項下色譜條件測定，將所得色譜圖導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.130723版)，使用平均數法生成復方魚腥草合劑指紋圖譜的對照模板，見圖1。

圖1 復方魚腥草合劑對照指紋圖譜

取15批復方魚腥草合劑樣品，根據2.1項下方法分別制備供試品溶液，使用2.5項下色譜條件測定，將所得色譜圖與對照模板一同導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.130723版)，以對照模板作為參照圖譜，設相似度為1.000，計算15批復方魚腥草合劑的相似度，結果見表1、圖2。

表1 復方魚腥草合劑樣品相似度測定結果

圖2 復方魚腥草合劑樣品相似度測定色譜圖

經統計分析，此15批復方魚腥草合劑的指紋圖譜相似度均大于0.95，表明本方法穩定、可行，所得到的復方魚腥草合劑的指紋圖譜相似度良好。

2.8.2共有峰歸屬 取15批復方魚腥草合劑樣品，以及根據2.1～2.3項下方法分別制備的供試品溶液、單味藥溶液對照品溶液，使用2.5項下色譜條件下測定，將所得色譜圖進行對比。結合質譜數據，確定了16個共有峰，并對其進行歸屬。

對成分進行分析，5-羥甲基糠醛可能來源于輔料煉蜜；苯甲酸鈉和羥苯乙酯為添加的輔料；通過對照品比對，歸屬于魚腥草的為槲皮苷；歸屬于黃芩的為黃芩苷、漢黃芩苷和漢黃芩素；歸屬于連翹的為連翹酯苷E、連翹酯苷A和連翹苷；歸屬于金銀花的為綠原酸和隱綠原酸；樣品中無歸屬于板藍根的化合物，16個化合物的歸屬見圖3、表2。

表2 復方魚腥草合劑HPLC指紋圖譜共有峰的指紋與歸屬

3 討論

本實驗建立了復方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜，并且鑒定了16個共有峰，通過對照品確認了其中9個峰的化學本質，分別為綠原酸、隱綠原酸、苯甲酸鈉、連翹脂苷A、槲皮苷、羥苯乙酯、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素。同時測定了15批復方魚腥草合劑的指紋圖譜，其相似度高，表明此方法可以作為復方魚腥草合劑質控的依據。

該指紋圖譜的共有峰中，5-羥甲基糠醛可能來源于輔料煉蜜，防腐劑苯甲酸鈉和羥苯乙酯響應均較大，且屬于輔料，擬在合成對照指紋圖譜中扣除上述3個色譜峰。另外，由于黃芩藥材中的黃芩苷含量較高，峰響應較強，對指紋圖譜的建立影響較大。故在建立對照指紋圖譜模板時，扣除5-羥甲基糠醛、苯甲酸鈉、羥苯乙酯和黃芩苷色譜峰。

考慮到本制劑中主要成分為酚酸類和黃酮類，選擇使用酸溶液作為水相。本方法考察了不同濃度的甲酸水溶液、磷酸水溶液作為水相，結果顯示，0.1%磷酸水溶液有較好的洗脫和分離能力，故選擇其為水相。同時比較了甲醇和乙腈2種有機相，結果發現，甲醇可以較好地洗脫和分離樣品，故選擇甲醇為有機相。

復方魚腥草合劑由5種中藥組合而成，物質成分較為復雜，所以采用光電二極管陣列檢測器(PDA)在200～400 nm對復方魚腥草合劑的供試品溶液進行紫外掃描檢測，結果供試品在210 nm檢測波長下色譜峰信息量較大，各成分較穩定，分離效果較好，且魚腥草中特征性成分槲皮苷響應較大，故選擇210 nm作為測定波長[9]。此外，本實驗比較了3種不同的色譜柱(Besil 5 C18-B、Kromasil C18、資生堂Capcellpak C18，規格均為250 mm×4.6 mm，5 μm)和不同柱溫對特征峰分離度的影響，最終確定為Besil 5 C18-B，柱溫40 ℃。

指紋圖譜是一種能較為全面地呈現出樣品復雜性的方法[10]，近年來被廣泛應用于中藥研究的質量控制和評價[11-12]，具有整體性、模糊性、專屬性等特點[13]。結果表明，3個廠家15批復方魚腥草合劑HPLC指紋圖譜相似度均大于0.95，具有較好的一致性。綜上所述，本研究建立了復方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜，該方法樣品處理簡便、色譜條件簡單、結果準確、重復性好，可以作為復方魚腥草合劑質量控制的方法之一。