白芷 白術(shù) 白附子提取物對酪氨酸酶抑制作用的比較△

陳革豫，朱周靜，田航周，劉思雨，康翰林，王琪玉，王征

1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院/陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083

“美容美白”是每個時代亙古不變的話題，尤其在當(dāng)下，尋找中藥美白活性成分，開發(fā)毒副作用較小且美白功效明確的美白產(chǎn)品逐漸成為中藥美白的研究熱點[1-7]。于靜等[1]經(jīng)翻閱古籍并查閱了104部中醫(yī)中藥著作，共查出用于美白的外用古方119個，白芷是歷代醫(yī)家喜用的美白中藥之一，但這些美容方劑的現(xiàn)代應(yīng)用頗少，究其原因，主要是其美白機制尚不清楚，具體的美白活性成分尚不明確，另外，這些美白中藥中部分毒性成分的存在阻礙了其在化妝品中的應(yīng)用[8]。酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵酶，近年來，對于酪氨酸酶抑制劑的研究也較為多見[2，4]，其對延緩褐變和抑制黑色素形成具有重大意義[9-10]?；诖?，本研究選取了白芷、白術(shù)、白附子3種出現(xiàn)頻次較高的中藥，比較了其對酪氨酸酶的抑制作用，試圖追蹤中藥美白活性成分，以揭示中藥美白的作用機制以及物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 方法原理

在一定條件下，L-多巴能在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌，該物質(zhì)在475 nm處有最大吸收峰，而底物L(fēng)-多巴和酪氨酸酶吸收較小。若將中藥提取物加入其中，如果中藥提取物能夠抑制酪氨酸酶的活性，勢必會影響多巴醌的生成。測定加入中藥提取物前后多巴醌的生成情況，就可以判定中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用強弱。多巴醌生成減少越多，說明中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用越強，這樣可以比較中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用。對酪氨酸酶抑制作用強的中藥就可能作為美白的關(guān)鍵中藥。以此為指引進(jìn)一步分析就可以追蹤到中藥美白的活性成分。

2 材料

2.1 儀器

UV-2600型紫外-可見分光光度計[龍尼柯(上海)儀器有限公司]；GT10-1型高速臺式離心機、DT5-2型低速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司)。

2.2 試藥

L-多巴(上海源葉生物科技有限公司，純度：99%)；磷酸二氫鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)；所用試劑均為分析純；水為二次蒸餾水。

藥材購買于北京同仁堂西安西大街分店，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院雷國蓮教授鑒定均為正品藥材(符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定)。白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.產(chǎn)地四川；白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.產(chǎn)地浙江；白附子TyphoniumgiganteumEngl.產(chǎn)地河南。所有藥材先用蒸餾水洗去塵土，80 ℃烘干6 h備用。

3 方法與結(jié)果

3.1 中藥提取物的制備

各中藥提取物中浸出物含量應(yīng)符合《中華人民共和國藥典》2015年版中的相關(guān)規(guī)定。

3.1.1中藥水提液的制備 準(zhǔn)確稱取各中藥10.00 g，加水150 mL，浸泡30 min，大火煎煮至沸，改用文火微沸30 min，用4層紗布濾過，得濾液。濾渣再加水100 mL，煎煮2次，每次20 min，合并3次濾液。濃縮至約50 mL，靜置，次日8000 r·min-1高速離心(離心半徑為10 cm)30 min，取上清液定容于50 mL的量瓶中，制成相當(dāng)于生藥0.2 g·mL-1的溶液待用，用時稀釋10倍，相當(dāng)于生藥0.02 g·mL-1。

3.1.2中藥醇提液的制備 準(zhǔn)確稱取各中藥10.00 g，加入適量70%的乙醇，50 ℃超聲1 h，趁熱濾過，取濾液，倒入量筒中，量取體積，加入3倍量的無水乙醇，沉淀24 h。然后將提取物放入離心機4500 r·min-1(離心半徑為16 cm)離心30 min，取上清液，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，50 ℃蒸至無醇味，定容至50 mL量瓶中，制成相當(dāng)于生藥0.2 g·mL-1的溶液待用，用時稀釋10倍，相當(dāng)于生藥0.02 g·mL-1。

3.2 L-多巴的制備

精密稱取L-多巴0.148 g，加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)定容至100 mL，備用。分別取上述配制好的L-多巴1、2、3、4、5、6 mL定容至10 mL量瓶中，備用。

3.3 酪氨酸酶的制備

參照文獻(xiàn)[3]方法，進(jìn)行酪氨酸酶的制備。新鮮土豆去皮，洗凈，切塊，稱取土豆10 g，待用。研缽洗凈，取pH 6.8的PBS 10 mL，全部放入冰箱中-20 ℃冷凍30 min，取出，將冷凍好的土豆和冷凍過的PBS放在一起，搗碎，于離心機中4500 r·min-1(離心半徑為16 cm)離心10 min，取上清液，定容至100 mL量瓶中，即得酪氨酸酶溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.4 吸收波長的考察

精密量取pH 6.8的PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，常溫反應(yīng)40 min，得反應(yīng)液，對該反應(yīng)液、L-多巴及酪氨酸酶溶液這3種溶液進(jìn)行全波長掃描，測定吸光度(A)。結(jié)果見圖1。在本實驗條件下，L-多巴和酪氨酸酶反應(yīng)后在475 nm處有最大吸收峰，而此時L-多巴和酪氨酸酶本身的吸收均較小，故選擇475 nm為檢測波長。

圖1 L-多巴、酪氨酸酶反應(yīng)前后的紫外吸收光譜

3.5 反應(yīng)時間的考察

精密量取pH 6.8的PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，考察反應(yīng)不同時間(10、20、30、40、50、60 min)，反應(yīng)物在475 nm處的A，結(jié)果見圖2。表明當(dāng)反應(yīng)時間為40 min時，A最大，故選擇常溫反應(yīng)40 min。

圖2 酪氨酸酶催化氧化L-多巴反應(yīng)時間的考察

3.6 精密度試驗

精密吸取pH 6.8的PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，按照實驗方法進(jìn)行測定，分別測量6次，記錄A，其RSD為0.42%，表明該方法的精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗

精密吸取6份同質(zhì)量濃度的白芷水提液1 mL，按3.4項下的方法操作，分別記錄其3、4組的A，其RSD分別為0.68%、1.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.8 線性關(guān)系的考察

精密吸取pH 6.8的PBS緩沖液1 mL，不同濃度的L-多巴溶液1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，用紫外分光光度法在475 nm下測定A，以L-多巴溶液的濃度為橫坐標(biāo)X，A為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試驗條件下，L-多巴溶液濃度為0.75～4.51 mmol·L-1時符合比爾定律，線性回歸方程為Y=0.117 9X+0.271，r=0.999 3。

3.9 白芷、白術(shù)、白附子3種中藥提取物對酪氨酸酶抑制作用的比較

如表1所示，精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶1 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A1。A1值即為在本實驗方法下加入中藥提取液之前L-多巴在酪氨酸酶的作用下反應(yīng)后所得產(chǎn)物的吸收值。精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水2 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A2。A2值即為在本實驗方法下L-多巴和酪氨酸酶反應(yīng)前可能產(chǎn)生的吸收值。精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、中藥提取液1 mL、酪氨酸酶1 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A3。A3值即為在本實驗方法下加入中藥提取液之后L-多巴在酪氨酸酶的作用下反應(yīng)后所得產(chǎn)物的吸收值。精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、中藥提取液1 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A4。A4值即為在本實驗方法下加入中藥提取液之后但未加酪氨酸酶時可能產(chǎn)生的吸收值。按公式(1)計算中藥提取液對酪氨酸酶的抑制率(IR)。

表1 酪氨酸酶活性抑制實驗反應(yīng)體系 mL

IR=[(A1-A2)-(A3-A4)]/(A1-A2)]×100%

(1)

3.9.1白芷、白術(shù)、白附子水提液對酪氨酸酶抑制作用的比較 按表1方法進(jìn)行實驗，分別對未加入中藥提取液及加入白芷、白術(shù)、白附子水提液后酪氨酸酶催化L-多巴的反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，加入白芷、白術(shù)和白附子水提液后在475 nm處的A均有所降低，其中白芷水提液加入后降低最多。

圖3 加入中藥水提液前后的紫外吸收光譜

3.9.2白芷、白術(shù)、白附子醇提液對酪氨酸酶抑制作用的比較 按表1方法進(jìn)行實驗，分別對未加入中藥提取液及加入白芷、白術(shù)、白附子醇提液后酪氨酸酶催化L-多巴的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，加入白芷、白術(shù)和白附子醇提液后在475 nm處的A均有所降低，其中白芷醇提液加入后降低最多。

圖4 加入中藥醇提液前后的紫外吸收光譜

3.9.3白芷、白術(shù)、白附子各水提液和醇提液對酪氨酸酶抑制作用的比較 按表1方法分別測定了加入白芷、白術(shù)、白附子水提液和白芷、白術(shù)、白附子醇提液前后酪氨酸酶催化L-多巴的反應(yīng)產(chǎn)物在475 nm處的A，結(jié)果見表2。

表2 各中藥提取液對酪氨酸酶的抑制作用

4 討論與展望

本研究就歷代醫(yī)家喜用的美白中藥白芷、白術(shù)、白附子在同一實驗方法下測定了其各自水提液和醇提液對酪氨酸酶的抑制作用，結(jié)果表明，白芷對酪氨酸酶的抑制作用的確是這三者中最高的。該研究方法簡單易行，可以對比多種中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用，從而篩選出可能具有美白作用的中藥，進(jìn)一步分離可以追蹤到活性較好、安全性較高的天然美白活性成分，為中藥美容美白的研究提供了參考。