沙棘籽油微乳的處方篩選及制備工藝研究△

韓立柱，高歡，胡坤霞，汪蕓蘭，唐志書，宋逍，段璽

1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學 附屬醫院，陜西 咸陽 712000

沙棘為胡頹子科酸刺屬的灌木，別名醋柳、黑刺、酸刺。中國是最早利用沙棘資源的國家之一。早在公元8世紀，《四部醫典》就已出現對沙棘醫藥用途的記載[1]。沙棘具有祛痰利肺、養胃健脾、活血祛瘀的藥理功效[2]。沙棘籽油可從沙棘籽中提取，是棕紅色或棕黃色的透明油狀液體，為沙棘有效成分的濃縮物質，其中包含維生素E、胡蘿卜素、不飽和脂肪酸、黃酮類、酚類及甾體類等多種活性物質[3]，具有抗輻射、抗腫瘤、保護肝臟、調血脂、抗疲勞、增強人體免疫力、抗菌等特殊藥理性能，并有促進傷口愈合、緩解冠心病和心絞痛等功效，也可用做化妝品美容基料[4-6]。

微乳是由藥物、乳化劑、助乳化劑、油相、水相按照一定比例形成的粒徑為1～100 nm的均相分散系統[7-8]。微乳簡單來說可以分為3種類型，即水包油型微乳、油包水型微乳以及雙連續相型微乳[9]。本研究通過Box-Behnken響應面法優化了水滴定法制備沙棘籽油微乳的方法，得到了沙棘籽油微乳的最佳處方組成和制備工藝。該方法制備的沙棘籽油微乳外觀呈澄清或半透明狀液體，提高了沙棘籽油的溶解度和生物利用度，為沙棘籽油微乳的制備工藝優化及其開發應用提供參考[10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)；Zetasizer Nano ZS型粒度分析儀(馬爾文儀器公司)；Vortex-Genie2型漩渦混合器(北京卓信宏業儀器設備有限公司)；CJB-DS型磁力攪拌器(上海越眾儀器設備有限公司)；800型離心機(上海手術器械十廠)；SHZ-B型恒溫振蕩器(國華儀器制造有限公司)；N-1300型旋轉蒸發器(東京理化器械株式會社)；600Y型高速多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；BSA224S型分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

維生素E對照品(批號：S26A7I20052，純度≥97%)、肉豆蔻酸異丙酯(IPM，批號：Y17D10S106142)、棕櫚酸異丙酯(IPP，批號：T18J10T80193)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40，批號：Y18A10S86157)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(批號：D04M11L109245)均來源于上海源葉生物有限公司；聚山梨酯-80(天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)；聚乙二醇-400(PEG400，天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)；甲醇(賽默飛世爾科技公司，色譜純)；其余試劑為分析純。

沙棘籽為山西呂梁野生沙棘，經陜西中醫藥大學藥學院宋逍教授鑒定為胡頹子科植物沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟種子。

2 方法與結果

2.1 沙棘籽油的提取

沙棘籽挑選去除雜質，恒溫干燥箱中干燥，粉碎機粉碎，過四號篩，備用。精密稱取一定量沙棘籽粗粉，加入10倍量的石油醚，80 ℃水浴連續回流提取6 h，回收溶劑，得棕黃色沙棘籽油液體[11]，備用。

2.2 沙棘籽油維生素E含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇；檢測波長：292 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃[12-13]。

2.2.2對照品溶液的制備 取維生素E對照品20 mg置于25 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至量瓶刻度線，超聲20 min混合均勻，再精密移取10 mL的濃溶液置于50 mL的量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度線，超聲20 min混合均勻。最終得到質量濃度為0.16 mg·mL-1的維生素E對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 取沙棘籽油5 g置50 mL錐形瓶中，加入無水乙醇20 mL，抗壞血酸2 g，在100 ℃加熱條件下使沸騰；將40 g氫氧化鉀溶于50 mL蒸餾水中，取10 mL氫氧化鉀溶液加入至錐形瓶中，回流30 min；待其冷卻至室溫后將其移入分液漏斗中，加入蒸餾水50 mL，100 mL乙醚提取，然后再用50 mL乙醚提取2次，最后將3次提取得到的乙醚液合并，用蒸餾水不斷洗滌直至乙醚呈中性，然后加入無水硫酸鈉3.01 g，進行抽濾，除去其中不溶物，濾液在80 ℃水浴微熱蒸干，將殘渣用無水乙醇溶解于10 mL量瓶中并稀釋至刻度線，超聲20 min使其分散均勻，用微孔濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.2.4系統適用性試驗 取無水乙醇、供試品溶液、對照品溶液各10 μL，按照2.2.1項下色譜條件進行實驗。結果表明，維生素E的保留時間約為10.22 min，樣品中維生素E與其他組分可以分離完全，無水乙醇對維生素E測定無影響，理論塔板數按維生素E色譜峰計均不低于5000，符合規定，色譜圖見圖1。

注：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.溶劑。圖1 維生素E HPLC圖

2.2.5線性關系考察 取制得的對照品溶液，加無水乙醇依次進行2倍稀釋，按照2.2.1項下色譜條件測定，以含量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸。得到線性回歸方程為Y=53.533X+0.300 4，r=0.999 5。表明維生素E質量濃度為0.006 162 5～0.197 200 0 mg·mL-1，線性關系良好。

2.2.6精密度試驗 取2.2.2項下對照品溶液，在2.2.1項下色譜條件下重復進樣6次，記錄維生素E的峰面積，并計算RSD，結果RSD為2.07%。

2.2.7穩定性試驗 取同一批供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、16 h進樣10 μL，依法測定。記錄維生素E的峰面積并計算RSD，結果RSD為0.42%，表明樣品溶液在室溫放置16 h內基本穩定。

2.2.8重復性試驗 分別精密稱取同一批樣品6份，按照2.2.3項下的方法制備，依法測定峰面積值并用回歸方程計算含量，結果維生素E的平均質量濃度為0.026 4 mg· mL-1，RSD為0.45%。

2.2.9回收率試驗 取6份已知含量的5 g供試品，置于50 mL圓底燒瓶，分別加入與樣品中待測成分含有量相當的對照品，按照2.2.3項下方法進行供試品制備，依法測定，結果見表1。維生素E的平均回收率為99.87%，RSD為2.93%。

表1 維生素E加樣回收試驗結果(n=6)

2.3 沙棘籽油溶解度測定

取2 mL離心管分別加入1 g沙棘籽油和各組乳化劑、助乳化劑、油相1 mL，超聲20 min使其分散均勻，25 ℃振蕩24 h后2000 r·min-1離心15 min(離心半徑為10 cm)，取離心后的上清液1 mL于10 mL棕色量瓶中，加無水乙醇定容，超聲15 min使其分散均勻，過微孔濾膜，取續濾液，于高效液相色譜儀進樣，檢測維生素E的峰面積，計算沙棘籽油中維生素E在不同基質中的溶解度[14]，結果見表2。

表2 維生素E在不同基質中的溶解度 mg·mL-1

2.4 基質選擇

2.4.1油相的選擇 以RH40為乳化劑，PEG400為助乳化劑，將RH40與PEG400以質量比為2∶1組成的混合乳化劑與IPM、IPP、大豆油這3個油相按照質量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1用磁力攪拌器混合均勻，磁力攪拌的同時加水滴定至形成澄清透明的微乳，記錄加水量，繪制偽三元相圖，篩選其最優油相，結果見圖2。

圖2 不同油相所得的偽三元相圖

2.4.2乳化劑的選擇 以IPM為油相，以PEG400為助乳化劑，RH40、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯80分別與PEG400以質量比為2∶1作為混合乳化劑，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進行混合，用加水滴定法，判斷由渾濁變為澄清的臨界點，記錄此時的加水量。繪出偽三元相圖，偽三元相圖中積分面積最大即為最優乳化劑，結果見圖3。

圖3 不同乳化劑所得的偽三元相圖

2.4.3助乳化劑選擇 以IPM為油相，以RH40為乳化劑，RH40與無水乙醇、甘油、PEG400以質量比為2∶1作為混合乳化劑，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進行混合，分散均勻，判斷由渾濁變為澄清的臨界點，記錄此時的加水量。繪出偽三元相圖，結果見圖4。

圖4 不同助乳化劑所得的偽三元相圖

2.4.4質量比的選擇 以IPM為油相，以RH40為乳化劑，以PEG400為助乳化劑，乳化劑與助乳化劑分別按照質量比為2∶1、3∶1、4∶1混合得混合乳化劑，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進行混合，判斷由渾濁變為澄清的臨界點，記錄此時的加水量。通過以上數據可以繪出偽三元相圖，結果見圖5。

圖5 不同乳化劑和助乳化劑質量比(Km)繪制的偽三元相圖

2.5 沙棘籽油微乳處方的優化

2.5.1Box-Behnken響應面法 根據2.4項下實驗結果，選擇最佳沙棘籽油微乳處方組成，繪制偽三元相圖，可明確各相含量范圍，應用Box-Behnken響應面法對實驗方法進行設計，用RH40(A)、PEG400(B)和IPM(C)的質量分數為自變量，以維生素E含量和微乳粒徑作為響應值，用軟件對實驗進行設計，確定沙棘籽油微乳的最佳處方用量[15-16]，設計結果見表3。

表3 沙棘籽油微乳Box-Behnken試驗設計

2.5.2模型擬合 按照上述試驗安排，稱取實驗設計比例的IPM、RH40和PEG400混合，用水加至15 mL，此時微乳為澄清透明，加入過量的沙棘油，形成淡黃色透明或半透明液體，超聲20 min使其混合均勻，然后以2000 r·min-1離心15 min(離心半徑為10 cm)，取上清液1.0 mL于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容，測定維生素E含量；另外將沙棘籽油微乳稀釋，然后使用激光粒度儀測定粒徑[17]。利用Design Expert 10.0.7軟件對測得的維生素E含量和粒徑進行二項式擬合，方差分析結果見表4～5。

表4 沙棘籽油微乳載藥量響應面回歸模型方差分析

表5 沙棘籽油微乳粒徑響應面回歸模型方差分析

在因素為載藥量時，得到的二元回歸方程：Y=3.449×10-3+9.762×10-5A+3.680×10-4B+4.661×10-4C-1.725×10-5AB+2.450×10-4AC+1.943×10-4BC-2.061×10-4A2-6.504×10-4B2-5.696×10-4C2，在交互項中C、B2、C2差異有統計學意義，A、B、AB、AC、BC、A2差異無統計學意義，比較F值可知各因素對響應值的影響大小為C>B>A，由顯著性大小可知，此設計模型擬合狀態良好，模型可用于沙棘籽油微乳載藥量實驗設計。

在因素為粒徑時，得到的二元回歸方程：Y=82.322-5.386 A-7.747 B+0.341 C+1.000 AB+7.750 AC-2.500 BC-12.175 A2-5.425 B2-27.675 C2，交互項中B、A2、C2差異有統計學意義，A、C、AB、AC、BC、B2差異無統計學意義，由顯著性大小可知，此設計模型擬合狀態良好，可用于分析沙棘籽油微乳最佳處方設計。

2.5.3響應面優化 采用Design Expert 10.0.7軟件繪制IPM、RH40和PEG400的不同比例對應不同響應值的效應曲面圖，將IPM、RH40和PEG400中的1個自變量固定，得出其中另外2個因素對維生素E含量及粒徑的效應曲面圖，得出沙棘籽油微乳最佳處方的各基質的量，結果見圖6～7。

圖6 沙棘籽油微乳載藥量響應面和等高線圖

圖7 粒徑響應面和等高線圖

2.5.4驗證實驗 由響應面分析結果得最佳處方比例為RH40∶PEG400∶IPM∶水(18.735∶6.327∶12.352∶62.586)，進一步檢驗響應面模型的準確度，將處方條件調整為RH40添加量19%，PEG400添加量6%，IPM添加量12%，水添加量63%，用磁力攪拌器使得其混合均勻，呈透明或半透明狀水樣液體，在磁力攪拌器攪拌的同時滴入沙棘籽油，平行3份，得淡黃色沙棘籽油微乳。按照色譜條件測定維生素E的平均質量濃度為0.004 mg·mL-1(RSD=2.45%)，粒徑平均值為81.173 nm(RSD=2.87%)，見圖8。結果與回歸方程的預測值基本接近，證實了該數學模型預測的準確性，故采用響應面法優化沙棘籽油微乳的制備工藝具有實踐和理論可行性。

圖8 沙棘籽油微乳粒徑圖

2.6 穩定性考察

根據優化后的最佳工藝制備沙棘籽油微乳，以高溫條件(60 ℃)、低溫條件(4 ℃)和離心條件進行10 d的快速穩定性考察[18]。

2.6.1溫度對微乳穩定性的影響 分別取3批沙棘籽油微乳置于60 ℃和4 ℃環境中，分別于第1、3、5、7、10天觀察是否有分層現象，測定其維生素E含量和粒徑，結果見表6。結果表明，在高溫和低溫條件下放置，維生素E含量影響無明顯變化，微乳的粒徑變化不大，表明所制得微乳穩定性良好。

表6 沙棘籽油微乳穩定性試驗結果

2.6.2離心實驗 取3批沙棘籽油微乳10 mL，置于離心管中，室溫下3000 r·min-1離心30 min(離心半徑為10 cm)，觀察微乳無分層現象。

3 討論

微乳是一個自發形成的各向同性、透明、熱力學穩定的分散體系，體系能否形成微乳，關鍵取決于水、油、表面活性劑和助表面活性劑的種類和比例。本研究以微乳作為藥物載體，將沙棘籽油制備成沙棘籽油微乳，以外觀、滴入油相中澄清度為指標，篩選乳化劑、助乳化劑和油相種類；記錄基質的相變點繪制偽三元相圖，研究微乳相及其他狀態的分布區域情況，考察不同組分配比時的性狀變化，乳化劑和助乳化劑質量比(Km)篩選時，隨著Km值的增大，微乳區域面積呈先增大后減小的趨勢，當質量比為3∶1時所得區域面積最大，可能是RH40相對含量增加時，乳化能力增強，能夠促進微乳的形成；當質量比為4∶1時，PEG400相對含量減少，體系增溶能力減弱、黏度增加，不利于微乳的形成；通過微乳相面積的大小判斷微乳體系的相對穩定程度，確定沙棘籽油微乳最佳基質用量范圍。在偽三元相圖的基礎上通過Box-Behnken響應面法進一步確定各基質的用量，以RH40、PEG400和IPM用量設計實驗，這3種因素對維生素E含量和粒徑的影響不是簡單的線性關系，特別是因素之間存在交互作用的，載藥量和粒徑結果的二項式擬合結果均具有顯著性差異，經優化后得到基質的最佳配比；預測模型和驗證實驗的結果基本一致，保證了該制備工藝穩定可行，沙棘籽油微乳的含量測定方法線性、穩定性和加樣回收率結果的RSD均小于3%，表明此方法穩定性良好，可用于維生素E的含量測定。綜上，本研究制備得沙棘籽油微乳工藝過程較為簡單、穩定可靠，能夠改善沙棘籽油溶解度較低的問題，增加其生物利用度，具有較高的臨床應用價值，為沙棘的綜合開發利用提供參考。