杜仲中京尼平苷酸的精制工藝對比△

陳驍鵬，吳蕓，葉慧

江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300

杜仲來源于杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，作為藥食兩用中藥，具有補肝腎、強筋骨、安胎的功能[1]，在藥品、保健品中應(yīng)用廣泛，如杜仲降壓片、參杞杜仲丸等[2-4]。京尼平苷酸為杜仲中主要代表性藥效成分，可用于改善阿爾茨海默病患者的記憶能力[5-6]。因該成分屬于環(huán)烯醚萜苷類，在提取精制過程中熱穩(wěn)定性差，長時間熱處理易分解，目前多以低溫、減壓的方式降低其氧化分解程度[7]。

納濾具有分離過程無熱效應(yīng)、效率高、不產(chǎn)生二次污染等技術(shù)優(yōu)點[8]。為了探索杜仲提取液中京尼平苷酸的濃縮精制工藝，以納濾膜孔徑、pH、跨膜壓力差為影響因子[9-10]，基于單因素考察，以京尼平苷酸截留率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計建立數(shù)學模型，優(yōu)化納濾濃縮工藝參數(shù)，進而與常規(guī)熱濃縮對比，為熱敏性環(huán)烯醚萜苷類成分的濃縮精制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(PDA)(美國Waters公司)；FL-3206型直流增壓泵(廈門優(yōu)美沃電氣有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KH-250B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；MS205DU型電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

杜仲藥材購自泰州市中醫(yī)院，批號：20190610010，經(jīng)江蘇省泰州市食品藥品檢驗所葉慧副主任中藥師鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，符合《中華人民共和國藥典》2015年版(一部)相關(guān)項下要求；京尼平苷酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111828-201001，純度≥98%)；聚酰胺納濾膜(孔徑分別為150、400、650 Da，星達膜科技有限公司)；甲醇為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 京尼平苷酸的含量測定

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-乙酸(24∶75∶1)[11]；檢測波長：240 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.1.2京尼平苷酸對照品溶液制備 精密稱取京尼平苷酸對照品0.010 60 g，置于10 mL量瓶中，加流動相溶液稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.06 mg·mL-1的京尼平苷酸對照品溶液。

2.1.3杜仲提取液制備 取杜仲飲片，加入10倍體積純化水，提取2次，每次1 h，0.45 μm微孔濾膜濾過，合并濾液，得杜仲提取液，用于單因素考察、響應(yīng)面法優(yōu)化以及工藝對比。

2.1.4線性關(guān)系考察 分別取京尼平苷酸對照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL，分別置于10 mL的量瓶中，流動相稀釋并定容至刻度，高效液相色譜儀檢測，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，得線性回歸方程：Y=12 827X-6 560.1，r=0.999 4。京尼平苷酸質(zhì)量濃度為10.6～212.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗 取質(zhì)量濃度為21.2 μg·mL-1的京尼平苷酸對照品稀釋溶液，重復(fù)進樣6次，按2.1.1項下色譜條件檢測，計算京尼平苷酸峰面積積分值的RSD為1.35%。

2.1.6穩(wěn)定性試驗 取杜仲提取液10 μL，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣，按2.1.1項下色譜條件檢測，計算京尼平苷酸峰面積積分值RSD為1.67%，結(jié)果表明，杜仲提取液中京尼平苷酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7重復(fù)性試驗 按2.1.3項下處理，平行制備5份杜仲提取液溶液，按2.1.1項下色譜條件檢測，京尼平苷酸質(zhì)量濃度的RSD為2.87%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收率試驗 精密吸取杜仲提取液(京尼平苷酸質(zhì)量濃度為152.0 μg·mL-1)6份，分別精密加入京尼平苷酸對照品適量，按2.1.1項下色譜條件進行定量測定，計算得平均回收率分別為98.70%，RSD為2.45%。

2.2 納濾濃縮操作方法

采用耐壓管路依次連接增壓泵、壓力表、納濾膜套件、壓力調(diào)節(jié)閥，取杜仲提取液置于儲液罐中，調(diào)節(jié)增壓泵轉(zhuǎn)速提供納濾分離壓力，分別收集納濾液及截留液，采用HPLC檢測，計算分析杜仲提取液中京尼平苷酸的截留率。

2.3 減壓濃縮操作方法

取杜仲提取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，由原體積2.0 L濃縮至200.0 mL，分別考察70、75、80、85、90 ℃加熱條件下，京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率，分析減壓溫度對成分影響。

2.4 計算方法

2.4.1截留率計算 分別精密吸取杜仲提取液、納濾液，按2.4項下的液相檢測條件，采用HPLC測定并計算樣品京尼平苷酸濃度，按式(1)計算京尼平苷酸截留率。

(1)

式中，R為成分的截留率；C1為納濾液中京尼平苷酸的濃度；C0為杜仲提取液中京尼平苷酸的濃度。

2.4.2轉(zhuǎn)移率計算 分別精密吸取杜仲提取液、減壓濃縮液，按2.4項下的液相檢測條件，采用HPLC測定并計算樣品京尼平苷酸濃度，按式(2)計算京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率。

(2)

式中，T為成分的轉(zhuǎn)移率；C2為減壓濃縮液中京尼平苷酸的濃度；V0為原溶液體積；V為減壓濃縮液體積。

2.5 單因素考察

2.5.1跨膜壓力差 膜分離的跨膜壓力差與膜分離效率直接相關(guān)，采用膜孔徑400 Da、pH 5.0為固定分離因素，考察跨膜壓力差分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 MPa時，京尼平苷酸的截留率變化規(guī)律。從圖1中可以得出，隨著跨膜壓力差的增加，京尼平苷酸截留率呈現(xiàn)出上升的趨勢，其中壓力差為1.0～1.5 MPa變化相對明顯，隨著壓力差超過1.5 MPa，京尼平苷酸截留率相對穩(wěn)定，但是跨膜壓力越大，膜通量越高，也與分離生產(chǎn)效率直接相關(guān)，但是也會加重濃差極化帶來的膜污染，導(dǎo)致使用壽命縮短[12]，因此選擇跨膜壓力差1.0～1.5 MPa用于納濾分離參數(shù)考察。

圖1 跨膜壓力差對京尼平苷酸截留率的影響

2.5.2pH 溶液pH與京尼平苷酸存在狀態(tài)相關(guān)，根據(jù)納濾分離的電荷排斥原理，結(jié)合納濾膜的酸堿耐用性，采用膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.0 MPa為固定分離因素，考察pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0對京尼平苷酸截留率的影響。

調(diào)節(jié)杜仲水提液pH，改變目標成分京尼平苷酸的解離狀態(tài)，從圖2中可以看出，隨著pH增加，京尼平苷酸截留率也隨之升高，此時的分離行為是孔徑篩分和電荷排斥共同作用的結(jié)果，也說明溶液中以離子形式存在的京尼平苷酸的比例也逐步增加，其中pH 5.0～7.0時變化相對明顯，同時為了控制堿性溶液環(huán)境下京尼平苷酸水解，選擇pH 5.0～7.0進行響應(yīng)面考察。

圖2 pH對京尼平苷酸截留率的影響

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化納濾濃縮工藝

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.06軟件，以納濾膜孔徑、pH和跨膜壓力差作為變量，以-1、0、1代表變量水平，進行Box-Behnken設(shè)計三因素三水平試驗方案，優(yōu)化京尼平苷酸的納濾濃縮工藝參數(shù)。

2.6.1響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理[13]，基于單因素試驗確定的因素考察范圍，為保障結(jié)果的準確性，采取平行3次計算截留率平均值。選取膜孔徑(A)、跨膜壓力差(B)、pH(C)3個因素，通過三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，通過17組試驗考察不同組合參數(shù)對京尼平苷酸納濾截留率的影響規(guī)律。所考察的因素水平及結(jié)果見表1。

表1 京尼平苷酸納濾分離的響應(yīng)曲面因素水平及結(jié)果

利用Design-Expert 8.06軟件，以京尼平苷酸截留率為響應(yīng)值，對上述3個因素進行二次多項回歸計算。

R=89.64-10.15A+3.77B+3.49C+2.00AB+1.93AC+1.30BC-6.08A2-2.06B2+0.017C2

(3)

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表2，膜孔徑(A)、跨膜壓力差(B)、pH(C)對于京尼平苷酸截留率影響差異有統(tǒng)計學意義，同時AB、AC因素交互作用顯著。該模型回歸F值為60.99，P<0.000 1說明該模型顯著，可根據(jù)響應(yīng)值預(yù)測京尼平苷酸截留率，且試驗設(shè)計方案正確。該模型多元r=0.987 4，預(yù)測r=0.912 8，調(diào)整r=0.971 2，均接近1.0，說明模型對試驗實際情況擬合較好。

表2 京尼平苷酸納濾分離響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析

2.6.2響應(yīng)曲面分析 多元回歸方程式所做的響應(yīng)曲面圖見圖3～5。由此可對考察因素交互影響京尼平苷酸截留率進行分析與評價，以確定最佳因素水平范圍。圖3顯示，在pH固定為6.0時，膜孔徑和跨膜壓力差對京尼平苷酸截留率的交互影響，在跨膜壓力差不變的前提下，隨著膜孔徑增加，京尼平苷酸截留率呈現(xiàn)出下降趨勢，此結(jié)果與膜分離原理中的篩分效應(yīng)相符合。在pH 6.0時，京尼平苷酸在水提液中以離子態(tài)和分子態(tài)的狀態(tài)共存，而隨著孔徑增大而出現(xiàn)截留率下降，說明此時分離是以孔徑篩分為前提。

圖3 膜孔徑和跨膜壓力差對京尼平苷酸截留率交互影響

方差結(jié)果顯示，膜孔徑與pH存在交互作用，在跨膜壓力差固定為1.25 MPa時，響應(yīng)曲面圖見圖4，在膜孔徑不變的前提下，隨著pH增加，截留率呈現(xiàn)出一定的上升趨勢，京尼平苷酸結(jié)構(gòu)中的酸性官能團逐步離子化，在荷負電性納濾膜的電荷排斥下[14-15]，京尼平苷酸難以接近膜表面，從而引起截留率升高。跨膜壓力差與溶液pH交互作用不明顯，從圖5的響應(yīng)曲面可以看出幾乎呈現(xiàn)平面狀。

圖4 膜孔徑和pH對京尼平苷酸截留率交互影響

圖5 跨膜壓力差和pH對京尼平苷酸截留率交互影響

在保障京尼平苷酸截留率的前提下，保障膜分離效率，利用Design-Expert軟件預(yù)測了最佳納濾分離參數(shù)為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.43 MPa，pH 6.83，結(jié)合實際分離參數(shù)的可操作性，調(diào)整為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.40 MPa，pH 6.80。

2.6.3納濾分離工藝驗證 根據(jù)響應(yīng)曲面法優(yōu)化出的分離參數(shù)進行3次平行分離驗證，在分離參數(shù)為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.40 MPa，pH 6.80時，杜仲提取液中京尼平苷酸平均截留率為(93.7±1.8)%，與理論截留率為95.0%接近。結(jié)果表明，響應(yīng)曲面法可用于杜仲提取液中京尼平苷酸的濃縮工藝優(yōu)化。

2.7 工藝對比分析

對比納濾濃縮和減壓濃縮對尼平苷酸截留率或轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖6。隨著減壓濃縮溫度升高，京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)出下降趨勢，其中溫度高于80 ℃時轉(zhuǎn)移率低于75%，成分損失明顯。而納濾的常溫濃縮優(yōu)勢相對明顯。通過常溫化操作熱敏性成分納濾濃縮，可以有效避免因熱處理成分氧化分解帶來的損失。

圖6 濃縮方式對京尼平苷酸截留率或轉(zhuǎn)移率的影響

3 討論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲含有環(huán)烯醚萜類、木脂素類、苯丙素類、黃酮類、甾類和萜類等成分，其中京尼平苷酸屬于環(huán)烯醚萜類，具有降血壓、抗衰老及抗腫瘤藥理活性，而因環(huán)烯醚萜苷類成分加熱易分解的客觀現(xiàn)狀，探索常溫化的濃縮精制工藝，對于杜仲藥材的深加工具有明確的實用價值。

Box-Behnken響應(yīng)曲面法通過在因素和響應(yīng)值之間構(gòu)建數(shù)學模型，對參數(shù)進行優(yōu)化分析，所建立的基于納濾分離技術(shù)的杜仲葉常溫濃縮模型，擬合程度高、實驗誤差小，可用于實際預(yù)測。在進行參數(shù)水平摸索時，溶液pH不僅影響京尼平苷酸在杜仲水提液中的解離狀態(tài)，在堿性條件也會促進氧苷堿的水解，因此需要在成分水解和離子化之間權(quán)衡，在保證離子化帶來的電荷排斥效應(yīng)提高截留率的同時，也要保障京尼平苷酸的穩(wěn)定性。

在保證京尼平苷酸的穩(wěn)定性、截留率，提升分離效率，優(yōu)化得到的納濾分離參數(shù)為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.40 MPa，pH 6.80，京尼平苷酸平均截留率為(93.7±1.8)%，與理論截留率為95.0%相近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化杜仲提取液的濃縮工藝條件可行，且優(yōu)于減壓濃縮的生產(chǎn)效率。