基于差向異構體分離的桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量測定△

霍文杰，丁青，劉曉霞，孫冬梅，黃敏燁，王利偉

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

桃仁味苦，性甘、平，具有活血祛瘀、潤腸通便、止咳平喘等功效，臨床上用于治療經閉痛經、癥瘕痞塊、肺癰腸癰、跌撲損傷、腸燥便秘、咳嗽氣喘等癥[1]。桃仁中主要有效成分為脂肪油與苦杏仁苷，其中苦杏仁苷具有抗動脈粥樣硬化、抗潰瘍和止咳平喘等藥理作用。桃仁配方顆粒是薔薇科植物山桃Prunusdavidiana(Carr.)Franch.或桃P.persica(L.)Batsch 的干燥成熟種子經炮制并按標準湯劑的主要質量指標，經現代工藝提取、濃縮、干燥等工序制成的配方顆粒。

《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版桃仁中已收載采用HPLC測定桃仁藥材中苦杏仁苷含量；《廣東省中藥配方顆粒標準(第一冊)》桃仁配方顆粒項下也收載了苦杏仁苷含量測定方法，兩者苦杏仁苷含量測定方法一致。此分析方法中所分離的苦杏仁苷色譜峰實際包含了D-苦杏仁苷與L-苦杏仁苷，當采用不同的色譜柱進行分析時，苦杏仁苷色譜峰會產生雙峰現象，根據相關文獻報道[2-3]，在高溫煎煮條件下，苦杏仁苷易產生異構化，具體表現為D-苦杏仁苷隨著水溫的上升異構化產生L-苦杏仁苷。自然界中不存在L-苦杏仁苷，但是在中藥湯劑、中藥配方顆粒中均存在L-苦杏仁苷。不同手性化合物，藥物活性、毒性差異較大。根據文獻報道[4]，L-苦杏仁苷沒有抗腫瘤作用，因此有必要對這2種手性化合物進行分開測定，以明確桃仁配方顆粒物質基礎。本研究測定桃仁配方顆粒中D-苦杏仁苷含量更具有針對性，進一步完善桃仁配方顆粒的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3型色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(默克股份有限公司)。

1.2 試藥

D-苦杏仁苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110820-201607，純度：90.7%)；乙腈、甲醇(默克股份有限公司，色譜純)；磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；其余試劑均為分析純；水為實驗室超純水系統(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

10批桃仁配方顆粒(廣東一方制藥有限公司，批號：TRKL01～TRKL10)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)為色譜柱，以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫(0～6 min，5%～10%A，6～11 min，10%～18%A，11～20 min，18%～40%A)；流速為0.4 mL·min-1；檢測波長為210 nm；進樣體積為1 μL；柱溫為20 ℃。

2.2 對照品溶液

精密稱取D-苦杏仁苷對照品2.644 mg，置20 mL量瓶中，加70%甲醇制成119.91 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

分別對桃仁配方顆粒含量測定方法的提取溶劑、提取方式及提取時間進行考察，確定含量測定供試品制備方法。

2.3.1提取溶劑考察 取桃仁配方顆粒適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，平行7組，每組2份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、80%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，分別用水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、80%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。結果表明，上述7種提取溶劑測得的苦杏仁苷質量分數分別為73.9、75.8、75.5、75.6、72.5、75.5、75.0 mg·g-1，70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇提取效率相當，考慮《中國藥典》2015年版一部桃仁藥材含量測定提取溶劑為70%甲醇，因此確定桃仁配方顆粒苦杏仁苷含量測定提取溶劑為70%甲醇。

2.3.2提取方式考察 取桃仁配方顆粒適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，平行2組，每組2份，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，分別超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。結果表明，2種提取方式測得的苦杏仁苷質量分數分別為74.6、70.8 mg·g-1，超聲提取比回流提取效率略高，因此桃仁配方顆?？嘈尤受蘸繙y定采用超聲提取方式。

2.3.3提取時間考察 取桃仁配方顆粒適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，平行3組，每組2份，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，分別超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)15、30、45 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液。實驗結果顯示，3種提取時間測得的苦杏仁苷質量分數分別為74.9、74.9、74.8 mg·g-1，可發現超聲時間對苦杏仁苷含量影響較小，為了確保充分提取，選取超聲時間為30 min。

2.3.4供試品溶液制備 取桃仁配方顆粒適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學驗證

2.4.1專屬性考察 精密吸取桃仁配方顆粒供試品溶液、D-苦杏仁苷對照品溶液與空白溶劑各1 μL，注入液相色譜儀，進樣測定，結果見圖1。結果表明，空白溶劑色譜中在與苦杏仁苷相應的保留時間沒有色譜峰，表明提取溶劑對苦杏仁苷的測定無干擾，專屬性良好。

注：A.D-苦杏仁苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.空白溶劑；1.D-苦杏仁苷；2.L-苦杏仁苷。圖1 對照品、供試品、空白溶劑色譜圖

2.4.2峰純度考察 精密吸取桃仁配方顆粒項下供試品溶液、D-苦杏仁苷對照品溶液各1 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件以二極管陣列檢測器(PDA)在190～400 nm進行掃描檢測，計算峰純度。結果表明，供試品溶液中苦杏仁苷未檢測到雜質峰，峰純度匹配值為999，說明在該色譜條件下，苦杏仁苷峰純度符合要求。并且樣品中苦杏仁苷色譜峰光譜指數與D-苦杏仁苷對照品光譜指數吸收曲線一致，在210 nm處有最大吸收，表明該方法能準確檢測D-苦杏仁苷色譜峰，無干擾。

2.4.3線性關系考察 精密稱取D-苦杏仁苷對照品8.995 mg，置20 mL量瓶中，加70%甲醇溶解，并稀釋至刻度，制成407.92 μg·mL-1的對照品溶液。

精密吸取對照品溶液4、3、3、2、1 mL，分別置5、5、10、25、100 mL的量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，制成D-苦杏仁苷質量濃度分別為326.34、244.75、122.38、32.63、4.08 μg·mL-1的對照品溶液。分別精密吸取上述6個不同質量濃度的對照品溶液1 μL進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)，苦杏仁苷的回歸方程為Y=0.037 8X-0.012 3，r=0.999 8，表明苦杏仁苷在質量濃度為4.08～407.92 μg·mL-1時，進樣濃度與峰面積線性關系良好。

2.4.4精密度試驗 精密吸取2.2項下D-苦杏仁苷對照品溶液，按照2.1項下色譜條件重復進樣6次，進樣體積為1 μL。計算峰面積RSD。結果表明，6次連續進樣峰面積RSD為0.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.5重復性試驗 取同一批次桃仁配方顆粒適量，按2.3.4項下供試品制備方法制備6份供試品溶液，進樣測定含量。結果表明，6份供試品中苦杏仁苷的平均質量分數為73.64 mg·g-1，RSD為0.57%，表明該方法重復性良好。

2.4.6加樣回收率試驗 對照品儲備液的制備：取D-苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成1 mg·mL-1的對照品儲備液。

分別按對照品加入量與待測成分含量之比分別為1.5∶1、1∶1、0.5∶1設計高、中、低3組實驗，每組平行3份。取具塞錐形瓶3組，每組平行3份，分別精密加入D-苦杏仁苷對照品儲備液1.8、3.7、5.5 mL，置具塞錐形瓶中，置氮吹儀下揮干溶劑，再分別稱取桃仁配方顆粒0.05 g，精密稱定，按苦杏仁苷含量測定方法制備9份供試品溶液，進樣測定，根據重復性考察結果中苦杏仁苷質量分數為73.64 mg·g-1計算準確度，見表1。結果表明，桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量測定分析方法回收率為96.09%～104.51%，符合《中國藥典》2015年版9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則要求。

表1 桃仁配方顆?？嘈尤受占訕踊厥章试囼?n=9)

2.5 樣品測定

對10批桃仁配方顆粒按2.1～2.3項下規定，進行樣品測定，苦杏仁苷含量測定結果見表2。

表2 10批桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量 mg·g-1

3 討論

3.1 苦杏仁苷差向異構體的分離優化

在現有文獻報道中桃仁配方顆?？嘈尤受蘸繙y定方法多采用HPLC，以甲醇-水為洗脫系統，該條件無法將苦杏仁苷中2種同分異構體進行分離[4]。根據文獻報道，苦杏仁苷在酸性條件下不易產生差向異構，D-苦杏仁苷難以轉化成L-苦杏仁苷，而在堿性條件下，D-苦杏仁苷穩定性差，容易產生差向異構，產生自然界不存在的L-苦杏仁苷[5-6]；參考文獻[6]中報道，單獨的D-苦杏仁苷以水為溶劑加熱回流時并不會產生L-苦杏仁苷，由此可見L-苦杏仁苷是桃仁中D-苦杏仁苷在高溫水環境下，桃仁中物質相互作用的結果。

本研究中發現，桃仁配方顆粒中苦杏仁苷2種同分異構體在柱溫為20 ℃時可以達到較好的分離。并對比乙腈-0.1%磷酸溶液與乙腈-0.5%冰乙酸溶液2種流動相系統對苦杏仁苷2種同分異構體的分離效果，結果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相系統時，苦杏仁苷2種差向異構體能夠進行有效分離。

3.2 討論

在本研究中同時采用超高效液相色譜串聯二極管陣列檢測器法(UPLC-DAD)對桃仁藥材中苦杏仁苷含量進行測定。結果表明，桃仁藥材液相色譜中含有L-苦杏仁苷色譜峰，但是該成分含量較低，按《中國藥典》2015年版桃仁項下苦杏仁苷含量測定方法測定時，測量誤差較小。但在桃仁配方顆粒中，L-苦杏仁苷與D-苦杏仁苷峰面積約為1∶1，表明L-苦杏仁苷在桃仁配方顆粒中大量存在，若采用原料藥材的含量測定方法則測定誤差較大。并且L-苦杏仁苷的臨床藥理藥效的研究尚未明確，因此2種差向異構體合并測定確有不合理之處。該方法測定桃仁配方顆粒中D-苦杏仁苷含量具有針對性，可更好地控制桃仁配方顆粒質量。