牛膝中皂苷和甾酮類物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理活性研究進(jìn)展△

羅懿釩，歐陽文，唐代鳳，程思佳，唐純玉，張云坤，王雄龍，周華榮，李順祥*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；3.湖南時代陽光藥業(yè)股份有限公司，湖南 永州 410116；4. 湖南省抗感染中藥工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 410116；5. 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410208

牛膝有懷牛膝、川牛膝和土牛膝之分。懷牛膝是莧科植物牛膝AchyranthesbidentataBl.的干燥根；川牛膝是莧科植物川牛膝CyathulaofficinalisKuan的干燥根；土牛膝是莧科植物牛膝A.bidentataBl.的野生種粗毛牛膝A.asperaL.及柳葉牛膝A.longifoliaMakino等的根及根莖[1-2]。來源不同，功效及臨床應(yīng)用也有較大差異。懷牛膝逐瘀通經(jīng)、利尿通淋、補肝腎、強筋骨；川牛膝逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋；土牛膝有活血散瘀、清熱解毒、利尿之功效[2]。牛膝的應(yīng)用在我國具有悠久的歷史，《本草綱目》對其有詳細(xì)的描述。牛膝的藥用價值與其本身所含有的化學(xué)成分是密不可分的。目前，從牛膝中分離得到的化學(xué)成分主要包括皂苷、甾酮、黃酮、糖、生物堿及有機(jī)酸等成分，其中皂苷類及甾酮類是牛膝的主要化學(xué)成分，同時也是公認(rèn)的主要活性成分。為了進(jìn)一步開發(fā)和利用牛膝資源，明確該藥的物質(zhì)及藥效基礎(chǔ)，本文從牛膝皂苷類及甾酮類化學(xué)成分、藥理活性及含量測定3個方面進(jìn)行綜述。

1 化學(xué)成分

1.1 三萜皂苷類化合物

三萜皂苷類化合物是中藥牛膝中主要的化學(xué)成分，其在懷牛膝、川牛膝和土牛膝中均有發(fā)現(xiàn)，也少見于日本牛膝(莧科植物日本牛膝A.faurieiLév. et.Van的根)。目前分離得到的三萜皂苷類的化學(xué)成分主要是以齊墩果酸為苷元的皂苷類成分，共有39個化合物(1～39)，其母核結(jié)構(gòu)見圖1，各化合物的名稱、取代基團(tuán)及來源見表1。

圖1 牛膝中三萜類化學(xué)成分1～39的母核結(jié)構(gòu)

表1 牛膝中三萜及其皂苷類化合物

續(xù)表1

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續(xù)表1

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1.2 甾酮類化合物

甾酮類被認(rèn)為是牛膝的第二類活性成分，其中懷牛膝主要含牛膝甾酮類化合物，川牛膝含有杯莧甾酮類化合物及其衍生物，目前從土牛膝中分離得到的甾酮類化合物較少。從牛膝中分離得到的甾酮類化合物有31個，化合物40～70的結(jié)構(gòu)和來源見表2。

表2 牛膝中甾酮類化合物

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

2 藥理作用

中醫(yī)研究理論認(rèn)為，懷牛膝逐瘀通經(jīng)、利尿通淋、補肝腎、強筋骨，主治月經(jīng)不調(diào)、腰膝酸痛、肝腎虧虛等；川牛膝逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋，主治風(fēng)濕痹痛、足痿筋攣、跌撲損傷等；土牛膝活血散瘀、清熱解毒、利尿，主治跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、白喉、咽喉腫痛等。藥理研究表明，懷牛膝具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗生育、抗腫瘤、抗衰老、抗炎及抗骨質(zhì)疏松等藥理作用；川牛膝具有調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗病毒、抗生育、抗腫瘤等藥理作用；土牛膝具有降糖、抗菌、抗病毒及鎮(zhèn)痛抗炎的藥理作用。皂苷及甾酮類化合物是牛膝主要的化學(xué)成分，同樣具有一定的藥理作用，但由于各品種所含的皂苷及甾酮類化學(xué)成分存在差異，可能導(dǎo)致牛膝不同品種藥理作用存在差異。

2.1 抗腫瘤作用

王一飛等[39]采用體內(nèi)實驗、體外實驗對牛膝總皂苷的抗腫瘤活性進(jìn)行研究，實驗結(jié)果表明，牛膝總皂苷的濃度升高后，體外實驗對艾氏腹水癌細(xì)胞的毒副作用逐漸增強，體內(nèi)實驗對小鼠肉瘤S180腹水性及肝癌實體瘤細(xì)胞的抑制率逐漸上升。因此推測牛膝總皂苷具有抗腫瘤作用。

尚風(fēng)琴[40]將懷牛膝和川牛膝進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性實驗，結(jié)果表明，甾酮類化合物表現(xiàn)出抗腫瘤活性，且懷牛膝甾酮類化合物抗腫瘤活性高于川牛膝。

2.2 鎮(zhèn)痛抗炎作用

Li等[41]研究了蛻皮甾酮(1種來自懷牛膝干燥根的甾酮)對輻射誘導(dǎo)的口腔黏膜炎的大鼠模型的治療效果，結(jié)果表明，蛻皮甾酮可通過上調(diào)有絲分裂原活化蛋白激酶(Ras-Raf-ERK)信號通路加速輻射誘導(dǎo)的口腔黏膜炎大鼠模型的愈合過程。

Xu等[42]研究了懷牛膝皂苷(ABS)對白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥和凋亡的保護(hù)作用，首次證明了ABS對IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，可認(rèn)為ABS可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在藥物。

Cao等[43]研究了川牛膝提取物及其有效部位對急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)及抗炎作用，并對其進(jìn)行成分分析。結(jié)果表明，川牛膝提取物及其有效部位能顯著降低血液、血漿黏度和體內(nèi)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)等因子的水平；并從川牛膝有效部位鑒定出40個化合物，主要為蛻皮激素類及皂苷類化合物，其中cyasterone和chikusetsusaponin Ⅳ可明顯抑制體外血栓素A2(TXA2)、內(nèi)皮素(ET)、丙二醛(MDA)、COX-2的水平并提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。說明川牛膝提取物及其活性部位對急性血瘀模型大鼠具有明顯的改善血液流變學(xué)和抗炎作用，其代表性成分cyasterone和chikusetsusaponin Ⅳ在體外具有明顯的抗炎、抗氧化和抗凝血作用。

2.3 抗生育作用

郭勝民等[44]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.12 g·L-1質(zhì)量濃度時，懷牛膝皂苷A對不同生理狀態(tài)下的大鼠離體子宮均有明顯興奮作用，但對幼齡子宮作用最弱，對晚孕子宮作用最強，對大鼠宮角平滑肌有明顯興奮作用，對宮頸興奮不明顯；且通過在體家兔子宮實驗發(fā)現(xiàn)，局部分別給予0.06、0.12、0.24 g·L-1劑量的懷牛膝皂苷A均有明顯興奮未孕及已孕家兔在體子宮的作用。

王世祥等[45]通過給小鼠灌服懷牛膝總皂苷，表明懷牛膝總皂苷具有明顯的抗著床、抗早孕作用，且呈劑量依賴性關(guān)系。朱和等[46]]實驗觀察了懷牛膝總皂苷對大、小鼠的抗生育作用。結(jié)果顯示，小鼠妊娠的第1～10天，灌胃給藥具有顯著的抗生育作用，且呈劑量依賴性關(guān)系；小鼠妊娠的第1～5天，懷牛膝總皂苷500 mg·kg-1灌胃給藥具有明顯的抗著床作用。但對大鼠250～500 mg·kg-1劑量灌胃給藥時無抗生育作用，2 g·kg-1灌胃給藥時也無墮胎作用。

2.4 抗骨質(zhì)疏松作用

孫奮勇等[47]制備牛膝含藥血清，醇提法制備牛膝脫皮甾酮，噻唑藍(lán)法(MTT)檢測兩者對體外培養(yǎng)的HOFB1.19的促增殖作用，實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測蛋白激酶A調(diào)節(jié)基Iβ(PKAR Iβ)的表達(dá)。結(jié)果顯示，牛膝含藥血清與牛膝蛻皮甾酮均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并導(dǎo)致PKAR Iβ表達(dá)的上調(diào)，可初步判定牛膝在體外有促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖的作用，其主要成分是蛻皮甾酮，并可能是通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行的。

董群偉等[48]研究了牛膝蛻皮甾酮對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用，發(fā)現(xiàn)懷牛膝蛻皮甾酮高、中、低3個劑量組均有改善骨密度和各項生物力學(xué)及骨形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的作用，表明牛膝蛻皮甾酮對卵巢大鼠骨質(zhì)疏松具有防治作用，并呈劑量依賴性。

任心慈等[49]研究了懷牛膝總皂苷對維甲酸所致骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)懷牛膝總皂苷可升高骨質(zhì)疏松大鼠血Ca含量、堿性磷酸酶(ALP)活性、血清骨鈣素(BGP)水平以及降低尿中羥脯氨酸水平。結(jié)果表明，牛膝總皂苷可改善患有骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝。

盧清秀[50]通過體內(nèi)藥效學(xué)實驗，建立了大鼠骨質(zhì)疏松模型及骨折模型，確定了懷牛膝甾體組分為治療骨質(zhì)疏松的主要有效性組分。在治療骨折過程中懷牛膝甾體組分和懷牛膝皂苷組分發(fā)揮了協(xié)同作用，均有治療骨折的作用。

2.5 降糖作用

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮甾酮在1×10-6～1×10-4mol·L-1的濃度能增加葡萄糖消耗量，且蛻皮甾酮的降糖效果隨葡萄糖濃度的升高而降低，說明蛻皮甾酮降糖作用是通過干細(xì)胞發(fā)揮作用的。通過胰島素抵抗細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)蛻皮甾酮在胰島素抵抗細(xì)胞模型中能增加胰島素的敏感性，改善糖代謝[51-52]。

2.6 對神經(jīng)系統(tǒng)的作用

孟大利[53]對懷牛膝總甾酮在改善腦功能障礙方面的作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，對環(huán)己酰亞胺所致小鼠記憶鞏固障礙有顯著的拮抗作用，懷牛膝總甾酮能顯著對抗東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙；同時懷牛膝總甾酮能顯著縮短氰化鉀所致的翻正反射消失時間及再探索時間，具有顯著的抗缺氧作用。王龍[54]研究發(fā)現(xiàn)，懷牛膝中蛻皮甾酮可通過抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性，增加腦內(nèi)乙酰膽堿含量，從而對中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生積極影響，發(fā)揮增強記憶力作用。

3 含量測定

衛(wèi)修來等[55]采用高氯酸-香草醛比色法建立懷牛膝中總皂苷含量的測定方法，對5批不同牛膝藥材進(jìn)行測定，經(jīng)計算總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.88%、6.47%、6.05%、5.70%、7.11%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.24%。楊柳等[56]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光檢測器法(HPLC-DAD-ELSD)同時測定懷牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量，結(jié)果測得10個不同批次的懷牛膝藥材中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.019～0.963、0.022～4.695、0.047～4.830 mg·g-1。王龍等[57]采用大孔吸附樹脂提取分離牛膝總甾酮，利用紫外分光光度法測定牛膝總甾酮含量，結(jié)果測得5批不同樣品的牛膝總甾酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.8%。

尚風(fēng)琴[40]通過大孔樹脂、十八烷基硅烷鍵合反相硅膠色譜柱(RP-C18)等手段有效地富集其三萜皂苷類及甾酮類化合物，分別建立了懷牛膝和川牛膝皂苷類指紋圖譜和甾酮類指紋圖譜。根據(jù)指紋譜圖提供的信息，懷牛膝和川牛膝總皂苷分別占所有化合物含量的66.5%和52.5%。馬英等[58]用反相高效液相色譜法對16個不同產(chǎn)地的川牛膝中所含的杯莧甾酮進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明，各批次川牛膝中杯莧甾酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.47～3.48)×10-2mg·g-1，不同產(chǎn)地的樣品中杯莧甾酮含量不同。

黃志芳等[59]采用薄層色譜法和分光光度法對土牛膝中的齊墩果酸和多糖進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果齊墩果酸的提取率為0.88%，牛膝多糖的提取率為7.2%。歐麗蘭等[60]采用顯微鑒別、薄層色譜鑒別和HPLC對土牛膝進(jìn)行定性和定量鑒定，測得土牛膝中齊墩果酸和蛻皮甾酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.445 3%和0.103 3%。柳立新等[61]采用比色法測定甲醇回流提取、乙醇回流提取、水超聲提取、乙醇超聲提取及索氏回流提取制備的樣品溶液中總皂苷含量，結(jié)果表明，樣品溶液中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.36%、4.75%、2.63%、4.97%、2.14%。

4 結(jié)語與展望

本文綜述了懷牛膝、川牛膝和土牛膝皂苷類及甾酮類化學(xué)成分、藥理活性及含量測定的概況。迄今為止國內(nèi)外研究人員已從中分離得到了大量皂苷類、甾酮類等化合物，部分黃酮類、糖苷類、生物堿類及脂肪酸等化合物。懷牛膝、川牛膝和土牛膝在化學(xué)成分和藥理作用方面均存在差異，且皂苷及甾酮類含量均有不同，臨床上應(yīng)規(guī)范應(yīng)用，以保證療效及安全。牛膝的藥理作用廣泛，有關(guān)牛膝的藥理研究也更多停留在牛膝粗提物或其個別化合物上，且有關(guān)藥理藥效機(jī)制的文獻(xiàn)報道不全面，可更加深入地開展其單體化合物的藥效機(jī)制研究及臨床應(yīng)用方面的研究，有效利用牛膝的藥用價值。

不同來源之間的牛膝化學(xué)成分也存在較大差異，懷牛膝含齊墩果酸型三萜皂苷及蛻皮甾酮、牛膝甾酮等化合物，川牛膝主要含皂苷、阿魏酸及大量甾酮類化合物，土牛膝含齊墩果酸型皂苷及昆蟲變態(tài)激素蛻皮甾酮，其功效不同可能受化學(xué)成分差異的影響。且目前文獻(xiàn)報道主要集中在懷牛膝和川牛膝等方面，關(guān)于土牛膝的化學(xué)成分的相關(guān)文獻(xiàn)報道較少，近5年有關(guān)牛膝的文獻(xiàn)報道也相對缺乏。

目前，本團(tuán)隊對土牛膝各極性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，并對各極性部位及分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行體外抗炎活性篩選，以期更充分研究土牛膝的化學(xué)成分及其藥理作用。近年從粗毛牛膝首次分離得到了包括吲哚類生物堿、新異黃酮類等新結(jié)構(gòu)類型化合物，這些化合物與土牛膝清熱解毒的藥效是否有聯(lián)系，或者該植物是否還有更多更新穎化學(xué)成分，均值得進(jìn)一步深入探討研究。