劉艷敏，費以琳，黎星淼，王 寧，陳 沫，江秀秀*

(1.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院 婦科, 浙江 杭州 310006; 2.海寧市中心醫院 婦產科, 浙江 海寧 314408)

子宮內膜異位癥(endometriosis, EMS)患病率在育齡婦女中達到10%～15%，嚴重影響到婦女的身心健康。有研究報道，子宮內膜異位癥患者中星形膠質細胞被活化[1]，但是其具體機制仍不明確。子宮內膜異位癥是雌激素依賴性疾病，因此推測雌激素可能促進星形膠質細胞的增殖和侵襲。水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一類膜通道蛋白，其主要功能是提升水穿過質膜的效率， 維持細胞滲透壓平衡[2-3]。AQP2是AQPs家族中的一員，對不同時期子宮內膜AQP2的免疫組化分析發現，AQP2在人子宮內膜中均有表達，且其表達量隨月經周期而周期性變化[4-5]，表明AQP2可能在性激素作用下對子宮內液體平衡起著重要作用。同時最新的研究表明AQP2在外周神經病理性疼痛中扮演重要作用[6-7]，但是AQP2與星形膠質細胞的增殖和侵襲仍待進一步探究。本研究通過體外培養星形膠質細胞系U-87進行體外實驗，分析雌激素與星形膠質細胞增殖和侵襲之間的關系以及可能的機制。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

星形膠質細胞系U-87、17-β雌二醇和cell counting kit-8 細胞增殖-毒性檢測試劑盒(東仁化學科技有限公司)；兔抗PGE2抗體(Bioss公司)；兔抗NGF抗體和兔抗AQP2抗體(Affinity公司)；兔抗GAPDH抗體(Proteintech公司);PrimeScri? RT Reagent Kit with gDNA Eraser和 qPCR Kit(SYBR Premix Ex Taq)(TaKaRa公司);IL-1β酶聯免疫試劑盒、TNF-α酶聯免疫試劑盒和IL-6酶聯免疫試劑盒(杭州達文生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組處理：細胞以1 500個/孔鋪96孔板(每孔100 μL培養基)，細胞貼壁后，取U-87細胞進行分組處理：使用不同濃度的雌激素(0、10-12、10-10、10-8和10-6mol/L)處理U-87細胞，每個濃度3個復孔。分別在雌激素處理的0、24、48和96 h檢測細胞增殖侵襲情況，為保證雌激素的濃度，48 h后給細胞換液，仍然保證雌激素的濃度為0、10-12、10-10、10-8和10-6mol/L。

1.2.2 RT-qPCR 檢測mRNA：細胞貼壁后分別使用不同濃度雌激素處理細胞，24 h收樣，提取mRNA進行反轉錄，熒光定量分析PGE2、NGF、IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2、NGF、AQP2、AQP5和AQP8的mRNA表達變化。

1.2.3 Western blot 和ELISA檢測蛋白：取不同濃度雌激素處理的U-87細胞，提取細胞蛋白，分析雌激素處理后U-87細胞的PGE2、NGF、AQP2表達量變化。根據ELISA試劑盒根據說明書檢測不同濃度雌激素處理的U-87細胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的變化。

1.2.4 CCK8法檢測細胞增殖侵襲：CCK8法檢測不同濃度雌激素處理U87細胞增殖能力的影響。同時制備細胞懸液調整細胞至5×105個/mL，取細胞懸液100 μL加入Transwell上室；24孔板下室加入600 μL含20% FBS的培養基，設5個梯度，分別加入0，10-12、10-10、10-8和10-6mol/L雌激素；37 ℃培養24 h。取出Transwell小室，固定，結晶紫染色計數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 雌激素下調U-87細胞細胞因子及AQP2的mRNA表達

與對照組相比，雌激素抑制IL-1β、TNF-α、AQP2、AQP5、AQP8的表達；抑制效應呈一定范圍內濃度依賴性，10-7mol/L濃度雌激素抑制作用最顯著；而對IL-6的表達，則呈現低濃度促進，高濃度抑制的效應(圖1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖1 雌激素對U87細胞IL-1β、TNF-α、IL-6、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達的影響Fig 1 Effects of the estrogen on the mRNA expression of IL-1β, TNF-α, IL-6, AQP2, AQP5 and AQP8 in U87 cells n=3)

2.2 雌激素促進U87細胞PGE2、NGF mRNA表達

與對照組相比，雌激素對NGF、PGE2 mRNA表達均起到上調作用(圖2)。對于NGF的促進作用在10-8mol/L最佳，而對于PGE2的促進作用10-6mol/L 最佳。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖2 雌激素對U87細胞NGF及PGE2 mRNA表達的影響Fig 2 Effects of the estrogen on expression of NGF and PGE2 mRNA in U87 cells n=3)

2.3 雌激素調控U-87細胞PGE2、NGF、AQP2的表達

與對照組相比，雌激素對NGF、PG蛋白表達均有一定的上調作用(圖3)，且隨激素濃度增加，上調作用增強；而雌激素對AQP2蛋白表達呈抑制作用，隨激素濃度增加，抑制作用增強，與基因表達趨勢一致。

圖3 雌激素對U87細胞中PGE2、NGF、AQP2蛋白表達的影響Fig 3 Effects of estrogen on U-87 cell PGE2, NGF, AQP2 protein expression

2.4 雌激素對U-87細胞IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的調控

相比對照組，雌激素對IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白含量均有一定的下調作用(圖4)，呈現濃度依賴性，且以10-7mol/L濃度雌激素抑制作用最顯著，與qPCR結果相一致。雌激素抑制炎性細胞因子的表達。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖4 雌激素對U87細胞IL-1β、TNF-α、IL-6表達的影響Fig 4 Effects of estrogen on U-87 cell IL-1β, TNF-α, IL-6 protein expression n=3)

2.5 不同濃度雌激素對U87細胞增殖侵襲能力的影響

細胞增殖結果顯示，相比對照組，在0～48 h內，不同濃度雌激素組的細胞增殖均呈明顯上升趨勢，且在雌激素作用48 h時，10-10、10-8和10-6mol/L濃度組細胞增殖最強(P<0.05)，隨著雌激素作用時間的繼續延長，達到96 h后，各組細胞的增殖呈現下降趨勢。同時transwell結果顯示，相比對照組(0 mol/L)，雌激素濃度為10-8mol/L、10-6mol/L時，細胞遷移數顯著增加，且10-6mol/L相比10-8mol/L對細胞侵襲活性作用最顯著(圖5)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖5 雌激素對星形膠質細胞U-87增殖(左)、侵襲(右)的影響Fig 5 Effects of estrogen on the U87 cell proliferation (left), cell invasion n=3)

3 討論

EMS是雌激素依賴性疾病，子宮內膜異位癥的發生發展與雌激素密切相關。有研究報道，子宮內膜異位癥患者中星形膠質細胞被活化，而雌激素可以促進激活星形膠質細胞[8]，但是機制尚不明確。本研究通過體外培養星形膠質細胞，進行不同濃度雌激素處理，實驗結果表明，不同濃度的雌激素處理星形膠質細胞，抑制細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達，促進PGE2、NGF的表達，促進星形膠質細胞的增殖和侵襲。星形膠質細胞可以合成和釋放許多神經元必需的神經營養素和免疫細胞因子，如BDNF、NGF、IL-1、IL-6等。IL-1與星形膠質細胞的增殖和侵襲相關，而IL-6可能促進中樞神經活化[9]，因此雌激素抑制IL-1和IL-6的表達，有助于促進星形膠質細胞的增殖。神經生長因子NGF作為神經營養素家族中的一員， 激活的星形膠質細胞可以產生大量的NGF促進神經損傷修復，研究表明在一定程度上NGF促進星形膠質細胞的增殖和侵襲。

作為AQPs家族中的一員， AQP2除了介導液體轉運、維持機體滲透平衡外，可能還參與促進細胞遷移、調節脂肪和糖原代謝以及神經信號傳導等過程。疼痛是子宮內膜異位癥的重要表現之一，而最新的研究表明AQP2在外周神經病理性疼痛中扮演重要作用，推測AQP2與子宮內膜異位癥病理性疼痛相關。通過雌激素處理星形膠質細胞發現，雌激素處理組AQP2的表達顯著下降，雌激素抑制AQP2的表達，與之前研究一致[10]。同時AQP2與細胞的增殖和侵襲有關，有研究報道，在子宮內膜上皮細胞中，雌激素反應元件(estrogen response element，ERE)-AQP2信號通路調控雌激素促進細胞的增殖和侵襲[11-12]。因此，雌激素可能通過ERα調控ERE-AQP2的結合，釋放細胞因子活化星形膠質細胞，促進星形膠質細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，本研究通過研究雌激素處理星形膠質細胞觀察AQP2、NGF及細胞因子的表達變化，探究雌激素與星形膠質細胞增殖和侵襲的關系，確立雌激素下調AQP2的表達，調控細胞因子和神經營養素的表達，促進星形膠質細胞的增殖和侵襲。