基因治療濕性年齡相關性黃斑變性的研究進展

張 依，王文俊，楊安懷

0 引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)又稱為老年性黃斑變性(senile macular degeneration,SMD)，患者多為50歲以上，雙眼先后發病或同時發病，嚴重影響老年人的生活質量，是歐美等發達國家患者致盲最主要的原因。由于人口的老齡化，我國ARMD患者也日益增多[1-2]。目前，根據臨床表現及病理特征改變的不同可分為兩型：干性老年性黃斑變性(dry senile macular degeneration，dry-SMD)，或稱為非滲出型老年性黃斑變性(nonexudative senile macular degeneration)，或非新生血管性年齡相關性黃斑變性(non-neovascular age-related macular degeneration,non-NAMD)；濕性老年性黃斑變性(wet senile macular degeneration,wet-SMD)，或稱為滲出型老年性黃斑變性(exudative senile macular degeneration)，或新生血管性年齡相關性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration,NAMD)[1,3]。

1 NAMD的發病機制及致病因子

ARMD是一種多因素的變性疾病，其病因及發病機制尚不明確?？赡芘c遺傳易感性、環境暴露、營養失調、代謝障礙、視網膜的慢性光損傷等因素有關。隨著年齡增長，視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)功能障礙，RPE細胞內物質積聚，細胞外基質異常地聚集于基底膜，在RPE層與Brush膜之間聚集形成玻璃膜疣(drusen)，這種聚齊物沿著Brush膜擴散增厚，最終光感受器和RPE細胞逐漸死亡，這一階段的疾病稱為non-NAMD或dry-SMD[1，3]。隨著病變的發展，大多數ARMD患者的中心視力進行性惡化，這是由于感光細胞和RPE層細胞死亡增多，導致視網膜局部萎縮，稱為地圖樣萎縮。遺傳研究表明，補體介導的炎癥損傷在ARMD的易感性中起著重要的作用[4-6]，但它究竟是如何發揮作用還不得而知。總的來說，目前對于non-NAMD的發病機制還沒有足夠了解，因此無法確定其治療的發展路徑。

大約20%的non-NAMD患者由于脈絡膜和(或)視網膜深層毛細血管的異常生長，侵犯視網膜下空間，最終轉變為NAMD[3]。NAMD是以黃斑下脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成，血管發生滲漏、出血、水腫，最終形成纖維瘢痕為特點，致使中心視力進行性受損的嚴重致盲性疾病[1,7]。目前認為NAMD主要發病機制有以下兩點：(1)由于RPE細胞的應激或損傷以及相關的免疫反應促進血管內皮生成因子(choroidal neovascularization，VEGF)的產生，從而驅動CNV的形成[8]。(2)脈絡膜血管系統的退行性改變是促進病理性血管生成的另一個可能的因素。從早期的ARMD患者的檢查可以發現，脈絡膜毛細血管和Sattler層的血管減少和(或)血流灌注的減低，可促使病理性血管的形成。無癥狀的病理性血管的改變可引起脈絡膜缺氧及VEGF分泌增多，導致病變血管的形成[7，9-10]。VEGF在新生血管形成、血管滲透增加中發揮重要的作用。在VEGF家族中，有VEGF A～F六個成員，其中VEGF-A是動物模型和人類NAMD的關鍵因子[11-12]。臨床觀察表明，玻璃體腔內注射抗VEGF-A藥物，抑制了CNV的生成，減少血管的滲漏，顯著地改善了NAMD患者的預后。因此抗VEGF是治療NAMD的中心環節[12-13]。

2 基因治療的發展背景

目前，臨床上常用抗VEGF藥物治療NAMD，但是隨著大量的臨床應用，發現這種治療方法，需要頻繁持久的眼內注射，增加了治療成本，且容易并發眼內炎、眼壓升高及其他不良事件的風險，同時需要良好的依從性的配合，患者才得以保存中心視力[14]。隨著我國的人口老齡化，我們迫切需要給NAMD患者提供長期的治療方案，探索發展一種具有持續抗VEGF活性的治療方法，而基因治療為這種治療策略提供了一個可行的方案。

3 眼部基因治療的特點

基因治療的前提，需要將遺傳物質傳遞到宿主細胞，以糾正功能失調的基因或編碼成治療蛋白[15]?；蛑委熗ǔａ槍我蛩刈冃约膊。壳按罅颗R床試驗數據表明，基因治療在眼科多因素變性疾病中發揮作用，如糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)和ARMD[3,16-17]。

眼睛作為基因治療的靶器官，其優勢有以下幾點：(1)可以進行局部治療而不是靜脈注射，可以最大限度地減少基因載體的全身吸收，一旦被感染，眼部免疫相關機制會限制引發不必要的全身反應[18]。(2)由于眼睛體積小，極少量的載體濃度足以達到基因治療的水平。(3)眼部的局部解剖，顯示出高度的生理分隔，使特定的細胞群體容易成為治療目標。(4)光學介質的透明性使得眼科相關檢查如視網膜電圖(electroretinogram,ERG)、光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)、熒光素鈉眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)等易于進行評估[16]。

4 常見的基因治療NAMD的方法

基因治療NAMD可以提供長期持續表達抗VEGF作用的蛋白質。這種治療方式中，遺傳信息的傳遞需要病毒作為載體。目前用于眼基因治療的臨床試驗中常用的病毒載體包括腺病毒(adenovirus)、腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)載體，即細小病毒家族的小單鏈DNA病毒，以及逆轉錄病毒家族中的慢病毒(lentiviral,LV)即RNA病毒。這兩類病毒都可以轉染非分裂細胞，但腺病毒及AAV載體轉染細胞是不整合的，而LV載體可將外源基因整合到宿主細胞基因組中，具有更大的轉基因能力[13-14]。在成功轉染后，靶細胞轉錄并將病毒攜帶的遺傳物質轉化為治療蛋白，發揮治療的作用。

4.1色素上皮衍生因子色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)是一種較強的抗血管生成因子，在內皮細胞增殖過程中具有促進細胞凋亡的作用[19]。在2006年,Campochiaro等[20]發布了使用表達人PEDF的腺病毒載體(AdPEDF.11)進行Ⅰ期臨床試驗(NCT00109499)的結果。在他們的多中心、劑量遞增的研究中，給予28例晚期NAMD的患者玻璃體腔內注射AdPEDF.11，觀察發現注射后的幾個月，沒有嚴重的不良事件及毒副作用，而且其抗血管生成作用可以持續幾個月,高劑量載體治療組患者1a后的病變大小穩定?？寡苌苫钚约拜d體良好的安全性足夠支持Ⅱ期臨床試驗來測試載體的有效性。然而，可能由于以下原因，目前并沒有針對腺病毒的進一步臨床試驗：(1)Campochiaro等的研究小組早期進行的研究是在幾種小鼠模型中使用編碼人PEDF的腺病毒靶向抑制新生血管的形成[21-22]，在基因治療的發展史中，被證明與猝死有關[23]；(2)腺病毒缺乏靶向性，且具有較強的免疫原性，尤其是基因治療持續時間短等特點[24]，與基因治療NAMD需要長期穩定地表達抗VEGF蛋白的設計思路背道而馳。隨后Campochiaro等通過試驗使用表達人PEDF的AAV載體，研究抑制新生血管形成的作用[25]。AAV載體可持續表達人PEDF，在小鼠模型中尚未發現病毒毒性，長期表達PEDF對眼睛的影響需要進一步的研究，但利用AAV載體表達人PEDF在未來可能是一個可行的臨床試驗。

4.2可溶性的血管內皮生長因子受體-1由Genzyme贊助的Ⅰ期臨床試驗(NCT01024998)，是在美國四家視網膜門診所進行的一個劑量遞增的開放標簽試驗，可溶性的血管內皮生長因子受體-1(soluble VEGF receptor 1,sFlt-1)成為研究的靶點。在19例晚期NAMD患眼的玻璃體腔內注射編碼sFlt-1的AAV2載體(a recombinant AAV2 encoding sFlt-1，AAV2.sFLT1),隨訪52wk，通過測定房水中sFlt-1和AAV2中和抗體(neutralizingantibody，NAbs)的水平，證實了玻璃腔內注射所有劑量下都具有良好的耐受性。然而，在接受最大劑量的患者中，有50%患者沒有檢測到sFlt-1。在sFlt-1表達陽性的患者中，4/5患者沒有測到NAbs，而另1例患者的滴度非常低(1∶100)。在5例給予最大劑量而無sFlt-1表達的患者中，4/5患者的NAbs滴度較高，1例無NAbs。這項研究結果表明，需要對高劑量的AAV2.sFlt-1的安全性和有效性進一步驗證，同時，是否NAbs的存在對靶基因的表達有影響，尚須進一步的研究[26-27]。

在澳大利亞進行了第2個Ⅰ期、Ⅱa期的單中心、隨機對照臨床試驗(NCT01494805)，Ⅰ期、Ⅱa期分別招募9例患者和32例患者，符合入選標準條件下所有的患者在治療之初及第4wk接受玻璃體腔內注射雷珠單抗的治療，然后每4wk隨訪患者的不良事件及最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA)的變化,必要時可給予雷珠單抗的補救治療。Ⅰ期臨床試驗雖然不足以評價載體的療效，但可初步說明視網膜下注射rAAV.sFLT-1(AVA-101)的可重復性，值得注意的是，4/6接受治療的患者不需要補救治療，2/6患者在隨訪近4mo的治療期間需要1次補救治療[28]。因此該臨床試驗結果表明，視網膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的、耐受性良好，而Ⅱa期的臨床試驗進一步驗證了Ⅰ期臨床試驗的結果，但并沒有新結果的發現[29]。隨后，Rakoczy等[30]在前期的臨床研究的基礎上公布了Ⅰ期/Ⅱa期視網膜下注射rAAV.sFLT-1治療滲出性年齡相關性黃斑變性的臨床研究結果，結果同之前無異，同樣由于樣本量少，無法證實生物學效應，但它同樣證實了視網膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的，同時在老年人中耐受性良好。

4.3 AA8載體介導的抗人VEGF抗體片段Liu等[31]在表達人VEGF的轉基因小鼠中建立Ⅲ型CNV，通過視網膜下注射不同劑量的AA8載體介導的抗人VEGF抗體片段(AAV8-antiVEGFfab)，可以觀察到AAV8-antiVEGFfab的抗血管生成及抗血管滲透的作用。研究結果表明，小鼠眼部注射≥1×107基因拷貝數(gene copy,GC)的AAV8-antiVEGFfab比無載體注射可顯著地減少視網膜新生血管(neovascular,NV)的區域，劑量依賴反應可以被觀察到，≤3×107的GC可輕度地減少視網膜新生血管，≥1×108的GC可減少50% NV,3×109或1×1010的GC可幾乎完全消除NV。這項研究強烈地支持在NAMD患者中開展視網膜下注射AAV8-antiVEGFfab的臨床試驗。

AAV8-antiVEGFfab目前也被Regenxbio公司贊助的Ⅰ期臨床試驗(NCT03066258)作為研究目標，他們正在評估AAV8-antiVEGFfab(RGX-314)的安全性和耐受性，RGX-314是一種編碼可溶性抗VEGF蛋白的AAV8載體的藥物。RGX-314旨在對抗因眼睛中形成的NV而引起視力的喪失，從而減少對抗VEGF藥物注射頻率的需求。該研究中納入18例晚期NAMD患者，分別接受3種不同劑量的基因治療。從Regenxbio公司公布的Ⅰ期臨床試驗的中期數據可以看出，基因療法RGX-314在所有劑量下都是安全且耐受良好的，所有三組的蛋白質表達水平均呈劑量依賴性增高，抗VEGF藥物的注射頻率也呈劑量依賴性減少[27，32]。

4.4內皮抑素和血管抑素內皮抑素(endostatin)是膠原蛋白18的裂解產物，內源性內皮抑素在抑制實驗小鼠CNV模型中得到了驗證[33]。血管抑素(angiostatin)是纖容酶原的一個片段，在激光誘導的CNV大鼠模型中，視網膜下注射AAV-Angiostatin可以顯著減小CNV的病變范圍[34]。由Campochiaro等發布了針對晚期NAMD患者的Ⅰ期劑量遞增的臨床試驗——Endostatin/Angiostatin基因轉錄治療黃斑變性的研究結果(GME研究，NCT01301443)，檢測表達Endostatin/Angiostatin的馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)載體的安全性和生物活性。結果顯示，在該研究的受試對象中，房水中檢測到Endostatin/Angiostatin的水平與載體劑量相關，持續高水平的Endostatin/Angiostatin在眼內表達可減少FFA中CNV的滲漏，但并不能可靠地消除晚期NAMD患者視網膜下和(或)視網膜內液體。每個劑量組的受試患者的耐受性良好，沒有劑量限制的毒性，幾乎沒有眼部炎癥的發生。與手術相關的嚴重不良事件為黃斑裂孔，在治療過程中結局良好。因此視網膜下注射EIAV-Endostatin/Angiostatin(RetinoStat?)是安全的，耐受性良好，可持續的轉基因表達，重復性好[35]。

4.5抗VEGF rAAV-cDNA抗VEGF rAAV-cDNA(ADVM-022/ADVM-O32)是一種編碼阿柏西普(aflibercept)/雷珠單抗(ranibizumab)的優化的腺相關病毒載體的藥物，主要被用于玻璃體腔內注射，以傳遞目的基因和高水平表達治療蛋白。這些療法尚處于臨床前期的研究階段。目前，ADVM-022的臨床前期工作結束，結果顯示，在激光誘導的非人類靈長類動物的CNV模型中，玻璃體腔內注射ADVM-022的動物模型耐受性良好，可致持續生成aflibercept，類似于長期持續aflibercept作用的效果。此外，在激光照射前13mo給予ADVM-022可預防臨床相關的CNV病變的發生，類似于動物CNV模型接受aflibercept的護理標準。結果表明，單次玻璃體腔內注射ADVM-022可能為wet-ARMD提供一種安全有效的長期治療方案，并可能最終改善患者的視力結果[36]。ADVM-032仍處于臨床前期的研究階段，尚未公布相關研究的臨床前試驗的數據及結果。

4.6抗TANK結合激酶1單克隆抗體抗TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)，又稱NF-κB激活激酶(NF-κB-activating kinase,NAK)，是一種廣泛表達色氨酸、絲氨酸的激酶，它屬于非典型性的IκB激酶，在調節I型干擾素(interferon，IFN)的產生和IFN調節因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)與NF-κB的信號通路中起重要的作用[37]。在之前的研究中證實，TBK1參與多種細胞途徑的激活和促炎因子的產生，以及細胞生長和增殖等細胞穩態等功能[38-40]。并且，TBK1可誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖，是腫瘤血管形成的新介質，同時它也可以上調炎性因子的生成發揮促炎作用，盡管一些研究暗示了TBK1在血管生成和炎癥中的作用，但TBK1在CNV中的作用還未得到驗證[41-43]。而在Cui等[37]開展的試驗研究中證實，TBK1可以促進脈絡膜視網膜內皮細胞系(A choroid-retinal endothelial cell line,RF/6A)的增殖和成管，增加VEGF的表達，在激光誘導形成CNV的鼠模型中，玻璃體腔內注射抗TBK1單克隆抗體可顯著地減少CNV的形成，這個研究結果表明TBK1是治療NAMD的潛在靶點。

5 結局和展望

基因治療在眼病的治療和失明的預防方面顯示出巨大的前景。前期的臨床試驗數據表明，基因治療對視網膜和(或)脈絡膜CNV的形成、VEGF水平的高表達有抑制作用，但目前尚不清楚，長期持續有效的VEGF阻斷是否會對正常脈絡膜血管和視網膜光感細胞產生不良影響。此外，同抗VEGF中和蛋白的治療相似，抗VEGF基因治療效果的喪失是對NAMD的另一個重要的臨床問題。盡管基因療法在治療濕性年齡相關性黃斑變性中展現出積極的效果，但仍需要大量臨床前期的研究結果來驗證這些問題，同時可為后期臨床試驗奠定基礎。