大麥籽粒抗性淀粉含量快速測定方法研究

魏 霞， 陳功海， 龍周鍇， 范小峰，張文英， 徐延浩

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434100； 2.荊州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北荊州 434025)

抗性淀粉是指不被正常人體小腸所消化吸收的淀粉及其降解物[1]，能降低餐后血糖水平，調(diào)節(jié)腸道代謝，預(yù)防結(jié)腸癌，防止脂肪堆積和控制體重等[2-3]。大麥(HordeumvulgareL.)籽粒富含β-葡聚糖、抗性淀粉、γ-氨基丁酸和生育三烯酚等保健成分，是典型的藥食同源作物[4]。不同品系大麥籽粒抗性淀粉含量差異顯著[5-6]，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析[5]、QTL定位[4]等對抗性淀粉進(jìn)行的遺傳研究，為高抗性淀粉基因的精細(xì)定位及品種選育奠定了基礎(chǔ)。常用谷類抗性淀粉含量測定主要是基于酶解顯色法(AOAC，2002)[7]，該方法步驟繁瑣、耗時(shí)長、成本高。抗性淀粉測定方法是高抗性淀粉大麥遺傳研究與品種育種的瓶頸之一，亟待探索一種簡單、快速、低成本的抗性淀粉含量測定方法。

衰減全反射中紅外光譜(attenuated total reflection mid-infrared spectroscopy,ATR-MIR)和近紅外光譜(near-infrared spectroscopy,NIR)檢測技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、低成本、無損等特點(diǎn)，MIR光譜技術(shù)在麥芽品質(zhì)分類[8]、豆粕摻假識別[9]、小麥制品的嘔吐毒素污染水平快速測定[10]等方面已有應(yīng)用。NIR光譜技術(shù)在谷物蛋白定量分析[11-12]、淀粉含量測定[13]、種子活力指標(biāo)的測定[14]及稻谷膠稠度的測定[15]等方面已有應(yīng)用，并被應(yīng)用于甘薯[16]、馬鈴薯[17]和水稻[18]的抗性淀粉含量預(yù)測和材料篩選工作。但NIR光譜技術(shù)在大麥抗性淀粉含量的光譜測定還未見報(bào)道，也未見利用ATR-MIR法進(jìn)行谷物籽粒抗性淀粉預(yù)測的報(bào)道。

本研究擬利用ATR-MIR和NIR光譜構(gòu)建一種簡單、快速、低成本的大麥籽粒抗性淀粉含量預(yù)測方法，為大麥抗性淀粉育種建立一種快速、高效群體材料篩選方法；同時(shí)，比較ATR-MIR和NIR光譜技術(shù)對大麥抗性淀粉含量的預(yù)測性能，拓寬ATR-MIR光譜方法在谷物化學(xué)計(jì)量學(xué)方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存的136個(gè)有稃大麥為材料，其中114個(gè)組成校正集，22個(gè)用于驗(yàn)證模型，材料信息見表1。2017年5月對供試材料進(jìn)行收獲、脫粒、除雜、晾曬，室溫保存1個(gè)月后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 樣品制備

每份材料選取飽滿、無病害、無霉變、籽粒大小均勻度一致的樣品約5 g，經(jīng)干燥后用配有標(biāo)準(zhǔn)的0.8 mm篩板的旋風(fēng)粉碎機(jī)(Perten Laboratory Mill 3100)打磨成細(xì)粉，裝入紙袋中，經(jīng)干燥、平衡保持水分為13.00%，備用。

1.3 籽粒抗性淀粉的化學(xué)方法測定

供試大麥籽粒抗性淀粉含量化學(xué)測定參照AOAC 2002.02方法[7]，用Megazyme抗性淀粉試劑盒(Ireland. K-RSTAR)進(jìn)行測定。抗性淀粉含量(%)=[樣品吸光值/D-葡萄糖(1.0 mg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值]×(92.7/0.87)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.4 光譜采集

1.4.1 衰減全反射中紅外光譜的采集

采用美國賽默飛世爾科技公司帶有衰減全反射(attenuated total reflection,ATR)附件的Nicolet is5紅外光譜儀對校正集樣品進(jìn)行MIR光譜測定。光譜采集范圍設(shè)定為525～4 000 cm-1、分辨率為4 cm-1、掃描時(shí)間16 s。以空氣為采集背景，每個(gè)樣品測定后用無水乙醇擦拭探頭和檢測窗口，自然晾干后進(jìn)行下一個(gè)大麥籽粒樣品光譜的采集，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.2 近紅外光譜的采集

采用瑞典波通儀器公司生產(chǎn)的DA7200近紅外儀對校正集樣品進(jìn)行NIR光譜采集，光譜范圍設(shè)置為950 nm～1 650 nm，分辨率設(shè)置為2 nm，掃描32次。測定時(shí)使樣品盒中的樣品保持平整。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.5 樣本數(shù)據(jù)的劃分

將所有樣品的ATR-MIR和NIR光譜數(shù)據(jù)分別與抗性淀粉含量的化學(xué)方法實(shí)測值對應(yīng)整合后隨機(jī)分為校正集和驗(yàn)證集，在Unscrambler 9.7(美國CAMO公司)軟件中使用強(qiáng)影響點(diǎn)模型對校正集數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值去除，將剩余的校正集樣品用于模型的建立，而驗(yàn)證集樣品用于模型的驗(yàn)證。

1.6 光譜預(yù)處理

為了減少隨機(jī)噪音、光散射及基線漂移等對光譜的影響，在建立預(yù)測模型之前，運(yùn)用平滑(消除噪音)、多元散射校正(消除顆粒不均勻產(chǎn)生的散射對光譜的影響)、導(dǎo)數(shù)(消除基線平移或漂移)等方法預(yù)處理光譜，以提高模型的穩(wěn)定性。

1.6.1 衰減全反射中紅外光譜預(yù)處理

對ATR-MIR光譜的校正集數(shù)據(jù)進(jìn)行三種不同的預(yù)處理：高斯濾波平滑(gaussian filter smoothing，GFS)+基線位移校正(baseline offset correction，BOC；以下簡稱GFS+BOC)；多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)+savitzky-golay法一階求導(dǎo)(平滑點(diǎn)數(shù)15；以下簡稱MSC+1thD)；基線位移校正(baseline offset correction，BOC)+范圍歸一化(range normalization，RN；以下簡稱BOC+RN)。

1.6.2 近紅外光譜預(yù)處理

對NIR光譜的校正集數(shù)據(jù)進(jìn)行三種不同的預(yù)處理：面積歸一化(area normalization，AN；簡稱AN)；基線位移校正(baseline offset correction，BOC)+S-G卷積平滑法(saviteky golay smoothing，SGS；簡稱BOC+SGS)；標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate，SNV)+savitzky-golay法一階求導(dǎo)(平滑點(diǎn)數(shù)21；簡稱SNV+1thD)。

1.7 預(yù)測模型的評價(jià)與驗(yàn)證

用外部驗(yàn)證集數(shù)據(jù)檢驗(yàn)其預(yù)測值和實(shí)測值之間的符合程度，預(yù)測值數(shù)據(jù)和實(shí)測值數(shù)據(jù)之間的決定系數(shù)越大，平均相對誤差值越小，說明兩者間的符合程度越好，并通過方差分析檢驗(yàn)兩者間的差異性。最大主成分(principal components,PCs)設(shè)為20，通過殘余方差分析(residual validation variance)確定模型的最佳主成分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 校正集和驗(yàn)證集品種籽粒抗性淀粉含量統(tǒng)計(jì)分析

使用強(qiáng)影響點(diǎn)模型分別對ATR-MIR(圖1A)和NIR(圖1B)校正集進(jìn)行異常值分析，去除2個(gè)異常樣品(CSK-81-556和Adagio)，校正集剩余樣品數(shù)量為112個(gè)。校正集材料籽粒抗性淀粉含量最低為0.925%±0.023%(Zita，Weeah,TR06106)，最高為 6.315%±0.231%(WA13590)，平均含量為2.073%，變異系數(shù)為58.177%(表1)。驗(yàn)證集22個(gè)材料籽粒抗性淀粉含量最低為0.945± 0.050%(WA13240)，最高為6.125± 0.214%(WA86372)，平均含量為2.455%，變異系數(shù)為58.411%。由此可見，參試大麥材料抗性淀粉含量差異較大，校正集和驗(yàn)證集的分布在合理范圍，樣本數(shù)量已經(jīng)超過ATR-MIR和NIR基礎(chǔ)模型的要求。

A:衰減全反射中紅外光譜校正模型；B:近紅外光譜校正模型。

表1 供試大麥材料來源及籽粒抗性淀粉含量統(tǒng)計(jì)

(續(xù)表1 Continued table 1)

2.2 衰減全反射中紅外光譜最佳預(yù)測模型的篩選

A:光譜范圍在525～2 954 cm-1之間的ATR-MIR光譜；B:光譜范圍在950～1 650 nm之間的NIR光譜。

表2 大麥籽粒抗性淀粉衰減全反射中紅外和近紅外光譜最佳預(yù)測模型的篩選

2.3 近紅外光譜最佳預(yù)測模型的篩選

2.4 最佳預(yù)測模型的檢驗(yàn)

用驗(yàn)證集樣品進(jìn)行ATR-MIR和NIR光譜最佳預(yù)測模型的驗(yàn)證。使用BOC+RN預(yù)處理的ATR-MIR預(yù)測模型的相對誤差范圍為1.532%～23.941%，平均相對誤差為10.072 %；使用SNV+1thD預(yù)處理的NIR預(yù)測模型的相對誤差范圍為8.133%～29.913%，平均相對誤差為 17.400%(表3)。BOC+RN預(yù)處理的ATR-MIR預(yù)測模型驗(yàn)證集樣品的預(yù)測值和實(shí)測值之間的決定系數(shù)(R2)為0.941 0(圖3A)，SNV+1thD預(yù)處理的NIR預(yù)測模型驗(yàn)證集樣品的預(yù)測值和實(shí)測值之間的決定系數(shù)為0.842 9(圖3B)，這兩種最佳預(yù)處理的預(yù)測值與實(shí)測值之間沒有顯著性差異(Turkey 法多重比較)，而BOC+RN預(yù)處理的決定系數(shù)(R2)比SNV+1thD預(yù)處理的決定系數(shù)高，相對誤差平均值較SNV+1thD預(yù)處理的低。這與表2中的ATR-MIR光譜所建模型的所有決定系數(shù)都高于NIR光譜模型的決定系數(shù)，誤差值低于NIR光譜的誤差值結(jié)果一致，由此可見，ATR-MIR和NIR光譜技術(shù)都可以應(yīng)用于大麥籽粒抗性淀粉含量預(yù)測，ATR-MIR光譜技術(shù)具有更高的預(yù)測準(zhǔn)確性和精確度。

表3 大麥籽粒抗性淀粉衰減全反射中紅外和近紅外光譜最佳預(yù)測模型的驗(yàn)證

A:BOC+RN預(yù)處理的ATR-MIR光譜;B:SNV+1thD預(yù)處理的NIR光譜。

3 討論與結(jié)論

抗性淀粉作為一種新型膳食纖維，具有改善人類健康的巨大潛力[1-3,20]。近年來，高抗性淀粉谷物的遺傳和育種研究受到廣泛關(guān)注[21]。已有的研究表明，通過遺傳選擇提高大麥籽粒抗性淀粉含量是可行的[4-5]。遺傳選擇的一個(gè)重要前提是能高效篩選大量群體材料，獲得優(yōu)異株系。但現(xiàn)有谷物抗性淀粉測定方法繁瑣、耗時(shí)、成本高，研究簡單、快速、準(zhǔn)確的抗性淀粉測定方法，對于加速谷物高抗性淀粉育種具有重要意義[20]。

本研究基于ATR-MIR和NIR光譜技術(shù)，結(jié)合BOC、SGS、MSC、SNV等光譜預(yù)處理方式，采用PLS建立大麥籽粒抗性淀粉預(yù)測模型，通過對不同預(yù)處理的結(jié)果進(jìn)行比較分析，篩選出最佳ATR-MIR和NIR預(yù)測大麥籽粒抗性淀粉含量的模型，分別對這兩種最佳預(yù)測模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示預(yù)測值和真實(shí)值間沒有顯著性差異，表明ATR-MIR和NIR光譜模型均可代替化學(xué)測定法實(shí)現(xiàn)對大麥籽粒抗性淀粉含量的預(yù)測。與化學(xué)定量法相比，光譜方法對樣品進(jìn)行測定和分析的總時(shí)間少于5 min，極大的提高了測定效率，為大麥抗性淀粉研究和利用提供了新方法。但值得注意的是，ATR-MIR 和NIR光譜技術(shù)主要借助光譜反射進(jìn)行測定，本研究使用的材料全部為有稃大麥，該模型是否適用于裸粒大麥還需要更多的驗(yàn)證。

Ferreira等[22]使用這兩種光譜技術(shù)預(yù)測大豆樣品中的物質(zhì)含量，結(jié)果建議使用NIR光譜技術(shù)預(yù)測蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的含量，使用MIR光譜技術(shù)預(yù)測灰分和水分的含量。Sisouane等[23]認(rèn)為MIR比NIR光譜技術(shù)能更好的預(yù)測有機(jī)廢物和堆肥中有機(jī)碳和總氮含量。但Zhang等[24]的研究結(jié)果表明，在預(yù)測牛奶中的脂肪和蛋白質(zhì)含量上這兩種光譜技術(shù)沒有差異。本研究的結(jié)果表明，在預(yù)測大麥籽粒抗性淀粉上，與NIR光譜相比，ATR-MIR光譜的R2相對較高，RMSE相對較小，具有更好的預(yù)測性能。MIR光譜識別的是分子基團(tuán)的基本振動吸收，而NIR光譜識別的是分子基團(tuán)的合頻及倍頻振動，這可能是這兩種光譜定量分析具有不同的預(yù)測效果的原因之一。