櫻桃谷鴨ATF4基因SNPs篩查及生物信息學分析

譚光輝，覃媛鈺，李杰章，吳 磊，岳 雍，張依裕

(貴州大學 動物科學學院 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

轉錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是一種應激性轉錄因子，又稱環腺苷酸(cAMP)連接效應元件2(cREB2)，與氨基酸轉運和代謝、抗氧化應激、蛋白質穩態和鈣釋放密切相關，也可誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯和衰老，是內質網重要的調節因子[1-5]。已有研究發現，ATF4基因參與多種mRNA的表達，包括編碼骨鈣素沉積和肌肉肌纖維萎縮mRNA[6-7]。Sun等[8]對雞蛋殼品質性狀全基因組關聯分析發現，ATF4、PIK3C2G和ITPR2基因可作為提高蛋殼品質的候選基因，其中ATF4和ITPR2基因主要與蛋殼鈣化或鈣代謝有直接關系。ATF4基因在機體內與鈣離子釋放相關[9-12]，在家禽蛋殼腺形成過程中需要大量鈣離子沉積，ATF4基因作為鈣離子釋放調節因子之一，可能調控蛋殼腺部位鈣信號傳導，進而調控該部位鈣釋放，影響蛋殼品質。

櫻桃谷鴨原產于英國，由北京鴨和埃利斯伯雜交選育而成，因生長快、飼料轉化率高、產蛋率高、抗病力強等優點受到人們青睞。隨著現代養殖規模擴大，產蛋率提高，蛋殼破損帶來的經濟損失和蛋制食品安全等問題亟待解決。DNA混合池是將提取同樣特質的個體DNA按一定比例混合得到的DNA混合池，再經PCR擴增測序后直接檢測單核苷酸突變的一種成本低、效率高的方法[13]。為深入探究櫻桃谷鴨ATF4基因編碼區蛋白的性質與功能，避免人工選育和基因演繹造成的誤差，本研究以櫻桃谷鴨為試驗對象，DNA混合池擴增后直接測序法檢測櫻桃谷鴨ATF4基因編碼區單核苷酸多態位點(single nucleotide polymorphism sites，SNPs)，并對其進行生物信息學分析，為揭示該基因編碼蛋白理化性質、功能信息、遺傳特性及與蛋殼品質性狀的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

200只櫻桃谷鴨選自貴州大學家禽研究所科研農場，用醫學采血管鴨翅靜脈采血1～2 mL，使用生化科技有限公司DNA提取試劑盒提取血樣DNA，以1.5%瓊脂凝膠電泳檢測基因組DNA，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2 引物設計

根據Genbank數據庫中鴨的ATF4基因序列(登錄號：NC_040046.1)，利用Primer primer 5.0設計2對特異性引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 DNA混池構建及PCR擴增

取200個單樣母液DNA各2 μL構建DNA混池，以DNA混池為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系共20 μL，其中：模板DNA 1 μL， 2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火50 s，72 ℃延伸5 min，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 ATF4基因引物信息Table 1 The information of primers

1.4 測序與SNPs位點篩查

所得PCR產物經純化試劑盒純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果經DNAStar軟件中的MegAlign和Editseq程序進行SNP位點篩選和拼接，獲得櫻桃谷鴨ATF4基因編碼區序列。

1.5 等位基因頻率估算和生物信息學分析

參照文獻[14]方法進行等位基因頻率估算，參照文獻[15-16]方法進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 ATF4基因擴增結果

PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖膠電泳檢測，特異性好，條帶明亮清晰，與預設片段大小相符(圖1)。

2.2 SNPs位點篩查結果

如圖2所示，測序結果表明，櫻桃谷鴨ATF4基因CDS區共發現4個SNP位點，均處于外顯子3，分別是：A909G、G636A、G813A和T867A，由于SNP位點核苷酸的密碼子簡并現象，A909G、G636A和G813A未引起編碼氨基酸的改變，均屬于同義突變，而T867A位點屬于錯義突變，突變引起AAT編碼的天冬氨酸(Asn)突變為AAA編碼的賴氨酸(Lys)。

由表2可知，A909G、G636A、G813A和T867A這4個SNPs的等位基因頻率在突變前后均發生了變化，其突變前后差值分別是0.294 2、0.069 2、0.140 3和0.394 0。突變前后比對發現，G636A位點等位基因頻率在突變前后差異較小，而其他3個SNPs在突變前后等位基因頻率具有明顯差異，其中T867A突變位點突變后等位基因頻率差異最大，A909G位點次之。

M， DL2000 DNA marker；1～4， P1擴增產物；5～8， P2擴增產物。M， DL2000 DNA marker; 1-4， PCR product of P1; 5-8， PCR product of P2.圖1 ATF4基因PCR擴增結果Fig.1 PCR product of ATF4

圖2 櫻桃谷鴨ATF4基因PCR產物測序峰圖及SNP位點Fig.2 PCR product of ATF4 sequencing peak and SNP site in Cherry Valley ducks

表2 ATF4基因SNPs等位基因頻率估算Table 2 Allele frequency estimation of ATF4 gene

2.3 生物信息學分析

2.3.1ATF4基因mRNA二級結構預測與分析

通過在線(RNAfold web server)預測參考序列(XP_027306738.1)，對比參考序列和櫻桃谷鴨ATF4基因4個SNPs的mRNA二級結構(圖3)，4個SNPs均導致ATF4基因mRNA二級結構發生改變，致使自由能發生變化，自由能由-347.30 kcal·moL-1均減少到-349.60 kcal·moL-1，與參考序列相比，4個SNPs的變化相同。

圖3 櫻桃谷鴨ATF4基因mRNA二級結構Fig.3 mRNA secondary structure of ATF4 gene in Cherry Valley ducks

2.3.2 櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白理化性質分析

櫻桃谷鴨ATF4基因CDS區全長1 065 bp，擁有1個完整地開放閱讀框(open reading frame， ORF)，既有起始密碼子也有終止密碼子，編碼氨基酸354個，蛋白質理論等電點4.66，半衰期30 h，不穩定系數49.46。由表3可知，絲氨酸數量最多，共41個，占整個氨基酸組成的11.6%；色氨酸數量最少，占整個氨基酸組成的0.8%。

2.3.3 櫻桃谷鴨ATF4基因編碼氨基酸疏水性/親水性預測分析

由圖4可知，第201位纈氨酸疏水性最強(最高分值1.833)；第210位谷氨酸疏水性最弱(最低分值-3.256)。整條肽鏈中親水性氨基酸所占比例較多(69.744%)，因此預測此蛋白為可溶性蛋白。

2.3.4 櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白的信號肽分析

利用Signal P在線工具對櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白的信號肽進行預測(圖5)，結果包括3個重要參數(C值、Y值、S值)。C值代表剪切位點，C值在每個氨基酸都會有1個，剪切位點C值最大；S值是與每個氨基酸對應，其中在信號肽區域S值較大；Y值是綜合考慮S值和C值的參數。如圖5所示，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼的蛋白沒有信號肽，為非分泌蛋白。

2.3.5 櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白的N-糖基化位點預測分析櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白的N-糖基化位點預測結果見圖6。如圖所示，該蛋白中存在Asn212和Asn290這2個潛在的N-糖基化位點。蛋白質糖基化異常與腫瘤、神經退行性疾病、心血管病、免疫性疾病等密切相關[17-18]。因此，從本研究結果來看，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼的蛋白存在2個潛在的N-糖基化位點，可能與櫻桃谷鴨鴨疾病的發生相關。

表3 ATF4基因編碼蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of ATF4 encoding protein in Cherry Valley ducks

正值表示疏水，負值表示親水。The positive value meant the hydrophobicity， negative meant hydrophilicity.圖4 ATF4基因編碼氨基酸疏水性/親水性預測Fig.4 Hydrophobicity/hydrophilicity of ATF4 gene encoding amino acid

2.3.6 櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白二級結構和三級結構預測

ATF4基因編碼蛋白的二級結構主要由無規則卷曲和延伸鏈組成(圖7)。T867A突變位點為錯義突變，蛋白質的二級結構在該位點突變前后發生了細微變化。櫻桃谷鴨ATF4基因編碼的蛋白二級結構預測結果顯示：突變前，137個氨基酸構成α-螺旋，占總氨基酸的38.70%；18個氨基酸構成延伸鏈，占總氨基酸5.08%；197個氨基酸構成無規則卷曲，占總氨基酸55.65%；2個氨基酸構成β-折疊，占總氨基酸0.56%。突變后，138個氨基酸構成α-螺旋，占總氨基酸的38.98%；24個氨基酸構成延伸鏈，占總氨基酸6.78%；189個氨基酸構成無規則卷曲，占總氨基酸53.29%；3個氨基酸構成β-折疊，占總氨基酸0.85%。

圖5 ATF4基因編碼蛋白的信號肽預測Fig.5 Signal peptide analysis of amino acid encoded by ATF4 gene in Cherry Valley ducks

運用SWISS MODEL同源建模預測ATF4基因編碼蛋白的三級結構，結果提示，蛋白的三級結構在T867A突變前后發生了變化，延伸鏈明顯增多，α-螺旋和無規則卷曲較多，與二級結構預測結果相符(圖8)。

圖6 ATF4基因編碼蛋白的N-糖基化位點預測Fig.6 N-glycosylation site prediction of amino acid encoded by ATF4 gene in Cherry Valley ducks

A，突變前；B，突變后。h，α-螺旋；e，伸展鏈；t，β-轉角；c，無規則卷曲。A， Before mutation; B， After mutation. h， Alpha helix; e， Extended strand; t， Beta turn; c， Random coli.圖7 ATF4基因編碼蛋白二級結構預測Fig.7 Secondary structure prediction of ATF4 gene encoding protein

A， 突變前；B，突變后。A， Before mutation; B， After mutation.圖8 ATF4基因編碼蛋白三級結構預測Fig.8 Tertiary structure prediction of ATF4 gene encoding protein

3 討論

ATF4基因具有豐富的多態性，其多態與機體鈣離子的沉積和鈣代謝相關。Chen等[19]研究發現，豬ATF4基因存在5個單核苷酸突變，其中A159G突變位點對豬脂肪沉積和骨骼發育具有顯著影響，進一步驗證豬ATF4基因在脂質代謝和骨骼鈣的沉積有重要作用。Qu等[20]在人ATF4基因中檢測到18個單核苷酸多態位點(SNPs)，其中在核心啟動區域rs17001266 G/A和外顯子1錯義突變rs4894 C/A基因型分布與精神分裂癥顯著相關。Sun等[8]對雞蛋殼品質性狀全基因組關聯分析發現，雞ATF4基因外顯子3 rs2707 G/A突變位點與蛋殼強度有顯著影響。綜上研究可見，ATF4基因可能是影響畜禽機體骨骼鈣素和鈣化殼的主效基因或與控制該性狀的主效基因連鎖，可以作為候選基因提高家禽蛋殼品質的分子標記輔助選擇，通過選擇有利突變個體進行培育，提高蛋殼品質，在家禽分子育種上具有潛在應用價值。

蛋白質是生命活動的主要承擔者，其氨基酸序列決定了大分子將形成的折疊和最終結構，同時其結構影響著機體生命活動代謝，基因決定機體表型性狀最終通過蛋白質來體現。本研究中，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼的蛋白由354個氨基酸折疊而成，是親水性蛋白，屬于不穩定蛋白。蛋白質的穩定性與半衰期密切相關[21-22]，蛋白質的穩定性高則半衰期長。本研究中，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白不穩定系數49.46(>40)，屬不穩定蛋白類，但卻有較長的半衰期(30 h)，這種結果可能是由于ATF4基因編碼蛋白的理化性質與功能發揮之間沒有關系造成的。通過比較顯示，在不同物種中ATF4基因編碼區序列特性相似的氨基酸均有不同程度的差異，揭示在動物進化過程中該基因存在多態性。

在基因編碼區的核苷酸突變可能導致mRNA二級結構的變化，進而引起蛋白質空間結構的改變而影響其生物功能的發揮。本研究發現，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼區A909G、G636A、G813A和T867A這4個單核苷酸突變位點，mRNA二級結構預測顯示，4個SNPs與參考序列相比均引起mRNA二級結構的改變，自由能降低，導致mRNA二級結構穩定性增加，可能對基因表達效率具有影響，4個SNP位點突變前后基因頻率差異明顯，推測櫻桃谷鴨蛋殼品質有顯著影響。蛋白質二級結構是多肽鏈主鏈骨架以氫鍵排列成具有周期性結構的構象，本研究結果表明，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼蛋白的二級結構主要由α-螺旋、β-折疊、延伸連和無規則卷曲組成，其中α-螺旋和無規卷曲含量遠遠大于其他二級結構，對該蛋白質的穩定性具有顯著影響；該蛋白三級結構在T867A突變前后發生了細微的變化，與二級結構預測結果變化一致。結構的變化導致其相關生物功能及其對鈣離子的調控能力也會在一定程度上發生改變。信號肽存在于蛋白質N端，經過引導后蛋白質肽鏈可以進入腔內，定位蛋白質[22]。根據本研究結果，櫻桃谷鴨ATF4基因編碼的蛋白不存在信號肽，揭示該蛋白可能定位于細胞質基質或細胞器基質中，不屬于膜蛋白或分泌蛋白。此外，本研究還發現，在櫻桃谷鴨ATF4基因編碼的蛋白中存在2個潛在的N-糖基化位點，糖蛋白的蛋白結構共價結合糖鏈結構形成蛋白質糖基化位點，與蛋白質結構緊密相關，幾乎參與了所有生命過程，調節蛋白功能，參與蛋白修飾，細胞識別、分化、信號傳導等重要生命活動，表明櫻桃谷鴨ATF4與鈣信號傳導具有重要影響。本研究對櫻桃谷鴨ATF4基因編碼區的遺傳變異進行了檢測，檢測到1個錯義突變位點和3個同義突變位點，為通過遺傳標記改良鴨蛋殼品質提供參考。