一個伴不完全外顯機制的Alagille綜合征家系的遺傳學診斷

胡亞倩，鄭必霞，劉志峰，李玫，金玉，張志華

(南京醫科大學附屬兒童醫院 消化科，江蘇 南京 210000)

Alagille綜合征(ALGS)是一種常染色體顯性遺傳病，主要發生于兒童和青少年，病因為JAG1或Notch2 基因突變影響Notch信號通路，從而引起肝內小葉間膽管減少[1]。臨床上多因嬰兒期膽汁淤積癥就診，常伴有心臟疾病、骨骼異常、眼部異常和特殊面容等臨床表現。作者回顧一個家系中兩例ALGS患兒的臨床表現及基因檢測結果，并復習相關文獻，總結ALGS的臨床特征及遺傳特點，為臨床更好地選擇分子診斷方法并早期識別、診治ALGS提供思路。

1 病例介紹

1.1 病例一般情況

患兒之兄，6歲，5年前因“發現肝功能異常伴皮膚瘙癢1月余”至外院就診。大便黃色。查體：眼眶凹陷、前額突出、鼻梁低平、尖下頜，皮膚、鞏膜無明顯黃染(圖1左)；心前區可及3/6級收縮期雜音，無傳導；肝臟肋下2.5 cm、劍突下2.0 cm，質軟，邊緣光整，無壓痛；脾臟肋下未觸及。間斷口服“保肝、利膽、退黃”藥物治療。目前身高113.0 cm，體重17 kg，頭圍48.5 cm。

患兒，2歲7個月，因“反復皮膚瘙癢1年余”入院。大便黃色。查體：頭圍45.8 cm，身高85 cm，體重10 kg，眼距稍寬，下頜尖小，皮膚及鞏膜未見黃染，(圖1右)；心前區全收縮期3/6級雜音，無傳導；肝臟肋下2.0 cm、劍突下3 cm，質軟，表面光滑；脾臟肋下未觸及。

圖1 患兒之兄(左)及患兒(右)

父母否認類似病史，否認家族遺傳疾病史。

1.2 臨床檢查

1.2.1 檢查方法

患兒兄既往在外院行JAG1基因一代測序檢測。

采集患兒及其兄、父、母靜脈血3 ml(EDTA抗凝)送至北京全譜醫學檢驗實驗室，進行全外顯子組測序，外周血標本DNA抽提前，患兒監護人填寫知情同意書，本研究獲南京兒童醫院醫學倫理委員會批準。使用血液基因組柱式中量提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)提取基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進行。采用IDT公司xGen?Exome Research Panel v1.0捕獲探針與gDNA文庫序列進行液體雜交，將目標區域DNA片段進行富集，構建全外顯子文庫，通過Illumina公司 NovaSeq 6000系列測序儀進行高通量測序(PE150)，目標序列測序覆蓋度不低于99%。測序過程由智因東方轉化醫學研究中心完成。

對檢測出的致病可能性較高的基因變異，采用熒光定量PCR(qPCR)的方法進行驗證。qPCR的引物序列設計見表1。

表1 qPCR擴增的引物序列

對檢測出的大片段拷貝數變異，進一步采用CNV-seq分析。經DNA提取、打斷、文庫構建步驟，并經Illumina Hiseq系列測序儀測序完成，由Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數據，經檢測、過濾后由全譜?遺傳病精準診斷云平臺系統分析篩選，結合Decipher、ClinVar、OMIM、DGV、ClinGen、ISCA等數據庫比對，并結合劑量敏感性及臨床特征吻合度等要素綜合分析，對CNV的致病性進行分級。

1.2.2 臨床實驗室檢查結果

1.2.2.1 患兒之兄 2014年5月15日：血生化：丙氨酸氨基轉移酶1 353.0 U·L-1，天門冬氨酸氨基轉移酶953.0 U·L-1，谷氨酰轉肽酶537.0 U·L-1，肌酸酶同功酶53.2 U·L-1，堿性磷酸酶 736.6 U·L-1，總膽紅素36.0 μmol·L-1。經保肝、利膽退黃治療后2014年5月21日復查：血生化：丙氨酸氨基轉移酶 435.0 U·L-1, 天門冬氨酸氨基轉移酶 234.0 U·L-1,谷氨酰轉肽酶 295.0 U·L-1,肌酸酶同功酶41.0 U·L-1, 堿性磷酸酶544.0 U·L-1，總膽紅素35.71 μmol·L-1，直接膽紅素29.19 μmol·L-1，總膽固醇8.18 mmol·L-1，膽汁酸329.0 μmol·L-1；巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)DNA陰性；EB病毒抗體IgM陰性；TORCH：風疹病毒抗體IgG陽性，余陰性；凝血功能正常；傳染病4項陰性、銅藍蛋白正常；X線胸片：椎骨未及明顯骨質異常；心臟彩超：左右肺動脈狹窄、卵圓孔未閉；肝膽胰脾B超未見明顯異常。2017年10月17日門診隨訪：血生化：丙氨酸氨基轉移酶267.0 U·L-1，天門冬氨酸氨基轉移酶164.0 U·L-1，谷氨酰轉肽酶 456.0 U·L-1，總膽紅素26.87 μmol·L-1，直接膽紅素18.19 μmol·L-1，總膽固醇8.91 mmol·L-1。

1.2.2.2 患兒 2019年9月17日：血生化：丙氨酸氨基轉移酶115.0 U·L-1，天門冬氨酸氨基轉移酶102.0 U·L-1，堿性磷酸酶576 U·L-1，谷氨酰轉肽酶316 U·L-1，總膽紅素19.0 μmol·L-1，直接膽紅素12.7 μmol·L-1，總膽固醇7.31 mmol·L-1，總膽汁酸 41.6 μmol·L-1；傳染病4項、凝血功能、體液免疫、細胞免疫基本正常；EB-DNA、CMV-DNA陰性；EBV抗體、CMV抗體IgM陰性，銅藍蛋白正常；心臟彩超：(1) 先天性心臟病：房間隔缺損；(2) 主動脈瓣輕度狹窄；(3)永存左上腔靜脈；肝膽胰脾B超：肝臟形態欠規則，右葉斜徑82 mm、右肋下21 mm；脾臟肋下可及，肋間厚22 mm、肋下19 mm，脾內光點均勻分布；心電圖：竇性心律，P-R間期延長，右心負荷重？Q-T間期延長；X線胸片：心影飽滿，兩肺未及明顯異常，椎骨未及明顯異常。

1.2.3 基因檢測結果

1.2.3.1 患兒之兄 JAG1基因檢測(外院、Sanger測序)陰性。

1.2.3.2 患兒 采用芯片捕獲高通量測序的方法對先證者全外顯子組進行測序，結果提示：患兒chr20:10018949-10654178區段疑似存在約635 K大小的雜合缺失，缺失片段中包含完整的JAG1基因，進一步采用qPCR的方法驗證其JAG1基因外顯子雜合缺失。

1.2.3.3 家系中其他人 將正常對照樣本與先證者及其兄、父、母樣本進行同組qPCR檢測，以ALB基因為內參基因，對目標基因JAG1的1，21和26號外顯子的拷貝數進行檢測。結果發現：先證者、先證者之兄及先證者之父JAG1基因1，21和26號外顯子的拷貝數與正常對照的比值約為0.5，先證者之母JAG1基因1，21和26號外顯子的拷貝數與正常對照的比值約為1.0(圖2)，提示先證者及其兄、父JAG1基因1-26外顯子存在雜合缺失，先證者之母JAG1基因1-26外顯子拷貝數正常。qPCR檢測結果與全外顯子組測序結果一致，提示患兒及其兄都存在JAG1基因外顯子雜合缺失，且兩兄弟基因雜合缺失來源于其父親。

圖2 JAG1基因外顯子1-26雜合缺失突變qPCR驗證結果 ALB-Q：內參基因；JAG1-1Q：JAG1基因外顯子1；JAG1-21Q：JAG1基因外顯子21；JAG1-26Q：JAG1基因外顯子26

進一步采用CNV-seq檢測對患兒及其父親攜帶的累及JAG1基因的雜合缺失進行精確定位，發現患兒及其父親chr20:9965785-11725865位置存在約1.76 Mb的可能致病性CNV，其中包含JAG1基因與Alagille綜合征1型相關，按照ACMG變異評級標準，其生物及臨床意義為致病性變異等級。

2 討 論

ALGS(OMIM:118450)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，又稱先天性肝內膽管發育不良綜合征、動脈-肝發育不良，可累及肝臟、心臟、眼、骨骼、面部等多個系統，外顯率94%左右，臨床表現從沒有癥狀到危及生命的情況均可發生[2]。

1997年Oda等[3]首次報道了JAG1基因突變引起ALGS。JAG1基因定位于染色體20p12，編碼細胞膜表面蛋白Jagged1蛋白作為配體參與Notch信號通路[4-5]。2006年McDaniell等[6]報道了Notch2基因突變也可導致ALGS。Notch2定位于染色體1p11-p13，編碼Notch2跨膜蛋白作為Notch信號通路的重要受體。NOTCH信號對膽管的起源至關重要，在ALGS的病理生理中起著重要作用[7-8]。研究表明94%～96%的ALGS由JAG1基因突變導致，Notch2基因突變占1%～2%，研究并未發現特定的突變和表達的表型之間有相關性[2]。

ALGS常包括心臟、肝臟、骨骼、眼部異常及特殊面容五大臨床特征；也有學者把腎臟異常及血管畸形納入主要臨床特征。其他特點如身材矮小、發育落后、反復感染等亦可見。經典的ALGS診斷標準為肝組織活檢有肝內小葉間膽管數量減少或缺如，具有至少5個主要臨床表現中的3個，并排除其他可能原因。修訂的ALGS診斷標準認為符合4個或以上主要臨床表現也可診斷，如果已知有JAG1基因突變或陽性家族史時，1個以上主要臨床表現通常即可確診[9-10]。因此基因檢測技術在該疾病診斷中的價值進一步凸顯。本資料家系中患兒及其哥哥因皮膚瘙癢就診，查體有肝臟增大、心臟雜音、特殊面容，輔助檢查血生化顯示肝功能異常、直接膽紅素增高、γ-谷氨酰轉肽酶增高、膽汁酸增高等膽汁淤積表現，心臟彩超可見肺動脈狹窄、主動脈瓣狹窄、房間隔缺損、室間隔缺損等異常。兩兄弟同時存在肝臟膽汁淤積、心臟改變及特殊面容3項主要臨床表現，但基因檢測明確JAG1基因突變幫助盡早明確了ALGS的診斷。

治療方面，ALGS目前無明確的病因治療手段，主要為保肝降酶、利膽退黃、補充脂溶性維生素、維持營養等，定期監測臟器功能。一項對92例ALGS患者的研究[11]表明，隨著年齡的增長，膽管狹窄和纖維化的發生率顯著增加，最終導致肝硬化或肝衰竭而需要肝移植的患者大約為15%。Hadchouel[12]研究發現，肝移植后總的20年平均生存率為70%，Lee等[13]報道9例該病患兒肝移植后5及20年的生存率分別為88.9%和77.8%。嚴重膽汁淤積伴皮膚瘙癢的患兒經藥物治療無效后可考慮外科手術干預，阻斷腸肝循環，但ALGS患者的膽管發育不全可導致到達腸道的膽汁減少，因此ALGS外科手術治療效果通常比其他引起膽汁淤積的疾病治療效果差；進行性膽汁淤積伴頑固性皮膚瘙癢的患兒可考慮肝移植[14-15]。Cardona等[16]報道，83.3%的ALGS患兒在活體肝移植后瘙癢消失，肝功能檢查結果正常，提示嚴重肝型ALGS患兒肝移植后生活質量可有明顯改善。本資料家系中患兒及其哥哥在給予阿拓莫蘭、復方甘草酸苷保肝、熊去氧膽酸利膽退黃、補充脂溶性維生素等治療后肝酶明顯下降，但皮膚瘙癢改善不明顯。長期隨訪如皮膚瘙癢加劇必要時可行手術治療改善患兒生存質量。

患兒之兄5年前于外院就診，一代測序檢測JAG1基因陰性，但此次qPCR對其JAG1基因外顯子驗證發現患兒之兄存在JAG1基因的雜合缺失，提示一代測序的檢測方法對基因組拷貝數變異的檢測有一定的技術局限性。全外顯子檢測聯合Sanger測序對確定點突變的位點更有價值；全外顯子檢測聯合qPCR可用來檢測出較小的變異并進行驗證，但對大片段拷貝數變異的檢測不夠精確，CNV-seq檢測可更精確地檢測大片段拷貝數變異。因此，根據疾病的遺傳特點及基因突變的情況選擇合理的基因檢測手段，既能幫助臨床盡早明確病因和診斷、指導合理治療并判斷預后，也可為病人家庭減輕經濟負擔。

qPCR驗證提示患兒及其兄JAG1基因雜合缺失來源于其父親，但患兒父親臨床上無典型臨床表現，符合JAG1基因外顯率94%左右、可不完全外顯的遺傳特點[17]。該病不完全外顯的特點為疾病的診治帶來了困難。與該疾病相關的肝臟、心臟、腎臟、眼部病變可單獨或合并存在于其他綜合征或疾病中[18]，而某些滿足ALGS臨床特征的患者經基因檢測卻排除該疾病診斷，如Dyack等[19]報道的一個家系中5人患有Alagille-like綜合征卻為常染色體隱性遺傳。Kamath等[20]首次報道了兩例同卵雙生子ALGS表型不一致的案例，提示非遺傳因素在該疾病表型中有著重要作用。本資料家系中患兒父親與患兒存在相同的拷貝數變異，但無典型的臨床表現，也可能與非遺傳因素影響疾病表型有關，因此臨床對疑似ALGS的患者應適當放寬基因檢測指征，以期盡早明確診斷。

CNV-seq檢測發現，患兒及其父親chr20:9965785-11725865位置存在約1.76 Mb的致病性CNV。該突變的發現豐富了JAG1基因變異譜。姜濤等[21]也報道了chr20p12.2缺失致ALGS患兒1例。WES等基因檢測技術的發展和廣泛應用使得更多基因突變類型得以檢出，對疾病的認識得以進一步深入，反復膽汁淤積是兒科一個很棘手的問題，因此對反復膽汁淤積的患兒應盡早行基因檢測明確診斷并早期提供遺傳咨詢與指導。