m⁶A甲基化基因對皮膚黑色素瘤發病影響的分析

王淮 楊健康

【摘要】?目的?通過對皮膚黑色素瘤以及正常皮膚的m6A相關基因的表達和預后進行分析，探索皮膚黑色素瘤的發病機制。方法?從UCSC Xena上下載TCGA黑色素瘤病人和GTEx正常人皮膚組織的RNA表達數據，對文獻報道的23個m6A相關基因進行差異表達分析;對表達有差異的基因使用R語言survival包進行生存分析，并得到與預后關系最密切的基因;采用GESA分析方法預測預后相關基因富集的基因集。結果?表達分析找到的差異基因共有21個，其中與預后關系最密切的基因只有3個，分別是IGF2BP1、METTL3和YTHDC2。在GSEA分析中，IGF2BP1、METTL3和YTHDC2主要富集在心臟肌肉收縮、核苷酸切除修復、RNA降解、泛素介導的蛋白質水解、基礎轉錄因子、MTOR信號通路、非小細胞肺癌和胰腺癌等基因集。結論?m6A相關的基因中，IGF2BP1、METTL3和YTHDC2可能通過多種途徑影響皮膚黑色素瘤的發生，未來可能可以作為該疾病的預后標志或潛在治療靶點。

【關鍵詞】?m6A基因;黑色素瘤;表達差異;生存分析;生物信息學分析

中圖分類號：R394.3?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.002

【Abstract】?Objective?To explore the pathogenesis of skin cutaneous melanoma by analyzing the expression and prognosis of m6A-related genes in cutaneous melanoma and normal skin.Methods?RNA expression data of TCGA melanoma tissues and GTEx normal skin tissues were downloaded from UCSC Xena， and 23 m6A-related genes reported in literatures were analyzed for differential expression; survival analysis was carried out on genes with differential expression by using R language survival package， and genes most closely related to prognosis were obtained; GESA analysis method was used to predict the gene sets enriched in prognosis-related genes.Results?A total of 21 differential genes were found by expression analysis， of which only 3 genes were most closely related to prognosis， namely IGF2BP1， METTL3 and YTHDC2. In GSEA analysis， IGF2BP1， METTL3 and YTHDC2 were mainly enriched in gene sets such as cardiac muscle contraction， nucleotide excision repair， RNA degradation， ubiquitin-mediated proteolysis， basic transcription factors， MTOR signaling pathways， non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.Conclusion?Among genes related to m6A， IGF2BP1， METTL3， and YTHDC2 may affect the occurrence of skin cutaneous melanoma through multiple pathways， and may be used as prognostic markers or potential therapeutic targets in the future.

【Key words】?m6A genes; cutaneous melanoma; expression difference; survival analysis; bioinformatics analysis

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是較為常見的惡性腫瘤之一，起源于神經黑色素細胞，發病部位多見于皮膚、黏膜。其中皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）占全身腫瘤的1%，易發生淋巴結和血性轉移，惡性程度高，病情發展快，預后差。因此早期診斷、早期治療對本病患者起到至關重要的作用[1～2]。RNA甲基化修飾主要包括N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）、N7-甲基鳥嘌呤（N7-methylguanosine，m7G）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、N1-甲基腺嘌呤（ N1-methyladenosine，m1A）等，其中以m6A最為常見[3]。研究表明，m6A與急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）、原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell car-cinoma，CSCC）、乳腺癌（breast cancer）和前列腺癌（prostate cancer，PCa）等多種癌癥密切相關[4]。m6A是指腺嘌呤（A）的第6位氮原子（N）發生甲基化修飾，這是一個動態可逆的過程，可調節RNA的剪接、加工、翻譯以及降解等生理過程，從而影響癌癥的發生發展[5]。本課題組對m6A相關基因進行表達差異分析得到與SKCM有關的m6A相關基因，繪制每個相關基因的生存曲線，探究相關基因對SKCM預后的影響，并利用基因富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）預測相關基因在SKCM發生發展過程中的作用，旨在探究m6A相關基因與皮膚黑色素瘤的關系，為SKCM的早期診斷以及尋找藥物靶點提供理論基礎。

1?資料與方法

1.1?數據來源

從UCSC Xena（https：/xenabrowsers.net/）下載得到RNA-seq的FPKM值表達矩陣，正常皮膚的數據來源于The Genotype-Tissue Expression（GTEx），黑色素瘤數據來源于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）。上述表達矩陣來源于Toil流程[6]重新處理的RNA-seq原始數據，盡量減少了批次效應的影響。最終的合并數據集包括469例黑色素瘤樣本和812例正常樣本。

1.2?篩選差異表達基因

從已發表過的文章中收集到m6A相關的基因[7～9]共有23個，分別是：YTHDC1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF3、YTHDC2、HNRNPA2B1、YTHDF2、HNRNPC、RBMX、METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、RBM15、RBM15B、FTO、ZC3H13、ALKBH5、PCIF1、CMTR1、CMTR2。從所有基因的表達矩陣中提取上述23個基因的表達數據。使用R語言limma包對數據集進行差異表達分析，以P<0.05為篩選條件。

1.3?基因表達與SKCM預后的關系

使用R語言survival包對SKCM病人的生存數據進行分析，分析差異表達基因與生存時間的關系，P<0.05說明基因與疾病生存率顯著相關。

1.4?GSEA分析

根據基因在SKCM組織中的表達水平分為高表達組和低表達組，使用GSEA 3.0軟件對IGF2BP1、METTL3和YTHDC2的表達數據進行分析，從而發掘京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因集與SKCM發生發展有關的機制。按照GSEA默認參數，置換檢驗1000次進行富集分析，將錯誤發現率（false discovery rates， FDR）<0.05的基因集作為顯著富集基因集，最終得到可能受IGF2BP1、METTL3和YTHDC2表達影響的基因集。

2?結?果

2.1?差異基因篩選

正常皮膚和黑色素瘤的m6A相關基因的差異表達情況，如圖1、圖2所示。根據結果顯示，23個m6A相關基因中FTO和METTL14的P值分別為0.686和0.938，不具有統計意義。因此最終得到m6A相關差異基因共21個。

2.2?基因表達與SKCM預后的關系

如圖3所示，共3個基因與SKCM病人的生存時間相關，分別是IGF2BP1、METTL3和YTHDC2。根據結果，在生存年限相同的條件下，IGF2BP1基因低表達組的生存率高于高表達組;METTL3和YTHDC2基因高表達組的生存率高于低表達組。故可以初步將IGF2BP1、METTL3和YTHDC2作為評價SKCM預后的因素之一。

2.3?GSEA分析結果

結果見表1、圖4。根據GSEA結果顯示，與生存時間減少相關的IGF2BP1高表達組、METTL3低表達組以及YTHDC2低表達組主要富集在心臟肌肉收縮、核苷酸切除修復、RNA降解、泛素介導的蛋白質水解、基礎轉錄因子、MTOR信號通路、非小細胞肺癌和胰腺癌等基因集。結果提示IGF2BP1、METTL3和YTHDC2可能通過影響核苷酸切除修復、RNA降解以及其他癌癥過程，從而影響SKCM的發生發展。

3?討?論

SKCM全球每年新發287 723例，死亡60 712例[10]，預后極差。SKCM的發病原因還未明確，研究表明m6A對腫瘤的發生發展具有重要影響[11]，因此通過生物信息學分析方法初步推測m6A在SKCM發病過程中的作用。

我們通過查閱文獻，找到23個m6A相關基因，經過表達差異分析以及對基因表達與SKCM預后的影響分析，最終找到IGF2BP1、METTL3和YTHDC2這3個與SKCM發病和預后相關基因。

IGF2BP1是胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白家族（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein， IGF2BP）的重要成員之一，屬于結合蛋白，可以選擇性結合m6A甲基化修飾的mRNA。IGF2BP參與調控RNA的轉運、翻譯，細胞的增殖分化等重要生理過程[12]。有研究表明，IGF2BP1在多種腫瘤或腫瘤來源細胞中表達上調，在正常組織細胞中基本不表達[13]。我們的結果也顯示正常皮膚組織中IGF2BP1表達低，而黑色素瘤中表達上調且表達上調組生存率也較低。根據GSEA富集結果發現，IGF2BP1與心肌收縮基因集密切相關，有可能通過此途徑影響SKCM的發生發展。

甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）屬于甲基轉移酶復合物，對RNA的m6A甲基化修飾形成起著至關重要的作用。有研究表明，METTL3通過MMP2影響腫瘤的侵襲遷移[14]。我們的結果顯示METTL3在黑色素瘤中表達低于正常皮膚，低表達組生存率低。根據GSEA富集結果，發現METTL3與核苷酸切除修復、RNA降解、泛素介導的蛋白質水解等基因集關系密切，有可能通過影響這些基因集的功能從而在SKCM的發生發展中發揮作用。

YTH 結構域蛋白2（YTH domain-containing 2，YTHDC2）也屬于結合蛋白，能夠調控m6A位點識別，YTH蛋白家族的進化上保守的YTH結構域可以選擇性識別m6A[15]。經過分析觀察到YTHDC2在SKCM組織中低表達，低表達組生存率低。根據GSEA富集結果，發現YTHDC2與泛素介導的蛋白質水解、基礎轉錄因子、MTOR信號通路等基因集關系密切，可能通過影響它們從而影響SKCM的發生發展。

本研究通過比較黑色素瘤與正常皮膚組織的基因表達數據得到m6A相關基因的表達差異情況，從中篩選出了表達有差異且與預后關系最密切的3個基因，接著對這3個基因進行了GSEA基因集富集分析。結果顯示，IGF2BP1、METTL3和YTHDC2可能通過影響核苷酸切除修復、RNA降解、泛素介導的蛋白質水解、基礎轉錄因子、MTOR信號通路等基因集的功能，從而參與SKCM的發生發展。這些基因為SKCM的診斷以及進一步研究SKCM的藥物靶點提供了參考。

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（收稿日期：2020-08-11?修回日期：2020-11-11）

（編輯：梁明佩）