5 L發酵罐中糞腸球菌發酵工藝參數優化

郭建軍， 熊大維， 曾 靜， 魏國汶， 杜建華， 袁 林*

（1.江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096；2.南昌工學院，江西南昌 330108）

糞腸球菌是人和動物腸道的一類重要菌群，可參與機體多種代謝活動 （Ben等，2018；Hwanhlem等，2017），從健康動物腸道分離的有益糞腸球菌可作為動物微生態制劑，替代抗生素調節動物腸道平衡，提高抵抗力，抑制病原菌繁殖，防治動物的一些腸道疾病等 （Amachawadi等，2018；Allameh 等，2017； Chen 等，2017）。 影響菌株生產能力的因素不僅包括菌種本身的生理性能，還有外界的環境條件（胡紅偉等，2019；白文妹等，2017）。所以通過優化菌株的培養條件可改進發酵過程。

高密度培養是指在一定的培養條件和體系內，應用一定的培養技術在不影響胞內產物積累的基礎上，盡可能多的提高生物量 （劉開放等，2019）。研究表明，影響糞腸球菌增殖的因素有很多，如菌種的活力、培養代數、培養周期、培養液的初始pH、培養溫度、培養時間、接種量和增殖因子等 （吳軍林等，2018；焦月華等，2016；喬琳等，2015）。乳酸菌要通過高密度培養技術有效的降低代謝產物濃度從而消除反饋抑制、降低發酵液的黏度、增大體系初始溶氧濃度達到理想的高濃度活菌含量，需要優化一系列相關的工藝參數，從而對發酵過程進行嚴格的控制（劉香英等，2018）。目前已有一些對糞腸球菌益生菌高密度培養研究，但僅限于實驗室規模的小試水平，鮮見大規模中試水平的報道。本文在前期搖瓶發酵的基礎上研究了5 L機械攪拌罐中的發酵情況，對其中影響糞腸球菌生長的主要因素，如氣體環境、攪拌速度、中和劑、發酵恒定pH和碳源添加量等進行了考察，從而優化糞腸球菌在發酵罐中的發酵條件，為后續中試及生產放大提供一定的數據基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌株：糞腸球菌EXW27由本實驗室從健康仔豬腸道黏膜上選育并保藏。

種子和發酵培養基（g/L）：葡萄糖20 g、蛋白胨 20 g、酵母粉 9.0 g、檸檬酸氫二銨 3.5 g、K2HPO4·7H2O 3.75 g、NaAc·3H2O 6.25 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、MnSO4·H2O 0.45 g、組氨酸 1.4 g、碳酸鈣 10 g，pH 7.2，115 ℃滅菌 20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養 將保存在-20℃的菌種解凍后，接入制備好的種子培養基中，37℃、150 r/min條件下培養18 h即得到種子液。發酵罐初始培養條件：將種子液以3%（V/V）接種于裝液量為70%的5 L小罐，攪拌轉速100 r/min，不通氣，恒定pH 6.2，37℃恒溫培養至發酵結束。

活菌含量計數方法采用固體MRS傾注法，將待測發酵液用滅菌的磷酸鹽緩沖溶液按10倍梯度稀釋，至適宜梯度后取1 mL稀釋液加入培養皿中，用MRS瓊脂培養基傾注平板，于37℃培養48 h后計菌落總數，每個梯度3個平行值，結果以cfu/mL表示。

1.2.2 分批發酵條件優化 在5 L液體發酵罐中對糞腸球菌分批進行單因素試驗，選取影響因素包括氣體環境、攪拌速度、中和劑、發酵恒定pH和碳源添加量等進行優化，以最終收獲的發酵液中活菌數作為高密度發酵工藝的優化指標。每一步優化的結果都用于下一步的發酵過程中，根據不同條件下菌體的生長情況逐步確定最佳的小試發酵工藝。

在單因素試驗的基礎上，選取對E.faecalis EXW27生長影響大的三個因素：攪拌轉速、發酵恒定pH、碳源添加量，以乳酸菌活菌數為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的Box-Behnken Design（BBD）響應面設計，通過試驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優試驗條件。

1.2.3 補料分批培養 在分批培養最佳條件的基礎上，將種子液接種于5.0 L機械攪拌罐中，pH反饋補料分批培養，pH控制與補料關聯的參數設置為反向關聯，當pH大于設定值時啟動補料，在其他條件相同的情況下，以不補加葡萄糖發酵作為對照組。每隔2 h取樣，檢測發酵液中菌體活菌數。

1.3 數據處理 試驗所用到的數據分析軟件：Design-Expert（8.0.6b），SPSSStatistics（17.0）。

2 結果分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同通氣方式對菌體生長的影響 本試驗研究不同的通氣條件[a.空氣（V（N2）： V（O2）=79：21），b.氮氣，c.混合氣體（V（N2）：V（H2）：V（CO2）=80：10：10）]保壓 0.02 Mpa 對菌體生長的影響，以不通氣作對照，試驗結果見圖1。

從圖1中可以看出，不同的通氣條件對菌株EXW27的生長影響差異不顯著。在空氣保壓的條件下進行發酵培養時的發酵液活菌數最高，氮氣保壓和混合氣體保壓對菌體的生長無明顯促進作用，活菌數比空氣保壓時低，這表明發酵培養過程中的溶氧濃度對菌株EXW27的生長有促進作用，故選擇通空氣保壓。

2.1.2 攪拌速度對菌體生長的影響 提高攪拌轉速可以增加溶氧量，圖2表明，從發酵開始至發酵4 h處，3種轉速條件下的菌株生長情況一致，隨后，轉速為200 r/min菌株的生物量呈現先指數增加后緩慢減小的趨勢，轉速為100 r/min和300 r/min菌株的生物量上升緩慢。這說明，攪拌轉速對菌株E.faecalis EXW27的生長具有顯著的影響，過低會造成供氧不足，從而影響菌體生長；轉速過高產生的剪切力會對菌體造成一定損傷，使其過早衰亡或自溶。

2.1.3 不同中和劑對菌體生長的影響 本試驗比較12.5%氨水、4M NaOH溶液和3M Ca（OH）2溶液等不同的中和劑對試驗菌種生長的影響，試驗結果如圖3所示。

從圖3可看出，使用不同的中和劑菌體的生長過程相似，隨著碳源的消耗菌體濃度不斷升高，穩定期時用12.5%氨水做中和劑，發酵液活菌數達到了21.23×109cfu/mL，顯著高于用4M NaOH溶液和3M Ca（OH）2溶液做中和劑時的發酵液活菌數（P＜0.05）。以氨水作為中和劑，既可以調節培養液的pH，也可作為氮源被菌體利用，促進菌體的生長，氫氧化鈉與氫氧化鈣的效果明顯不如氨水，可能是在補堿的過程中使培養液中鹽離子濃度過高，影響了細胞內外滲透壓與細胞內外物質的運輸，不利于菌體的生長，因此選用12.5%氨水做中和劑。

2.1.4 不同pH對菌體生長的影響 由圖4可知，恒定不同pH對E.faecalis EXW27菌體生長影響差異性顯著（P＜0.05），pH維持較低水平時發酵時間偏長，且活菌數最低；pH維持較高水平時產酸量大，導致發酵培養的對數期時間較短。當發酵恒定pH為5.8時，E.faecalis EXW27進入對數生長期明顯加快，發酵時間適中，且發酵液活菌數最高，達到了22.97×109cfu/mL，綜合考慮，確定E.faecalis EXW27發酵恒定pH為5.8。

2.1.5 初始糖濃度對菌體生長的影響 為滿足菌體生長繁殖的需要，本試驗中將初始糖濃度從20 g/L逐漸增至50 g/L，發酵結果見圖5。

結果表明原培養基中的糖濃度無法滿足菌體在小試培養條件下的生長需求，提高初始糖濃度發酵至穩定期發酵液活菌數有顯著提升 （P＜0.05），但當初始糖濃度大于40 g/L發酵液活菌增加不明顯，說明較低濃度的糖對于菌體是一種碳源饑餓狀態。由于當初始糖濃度為40 g/L時，進入穩定期時間較其他處理最短，因此將培養基初始葡萄糖濃度調為40 g/L。

2.2 響應面試驗結果 在單因素試驗的基礎上，確定主效應因素為攪拌轉速、發酵恒定pH、碳源添加量，采用Box-Behnken設計原理，對E.faecalis EXW27培養條件進行了3因素3水平試驗，以發酵液活菌數（R）為響應值，試驗設計及結果如表1所示。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表1中所得數據ANOVA分析，各因素經過擬合得到的二次多項式回歸模型方程為R＝-93.653+29.061X1+0.658X2+ 0.049X3-0.025X1X2+0.004X1X3-0.001X2X3-2.601X12-0.005X22-0.001X32。

對回歸模型進行可信度分析和方差顯著性檢驗分析見表2。二次回歸模型的決定系數R2=0.99516，修正后決定系數R2Adj=0.98894，說明有98.89%的差異可用此回歸模型來解釋；模型的P值為0.0001＜0.01，F值為373.53，均可說明此模型顯著。且回歸方程中失擬項檢驗不顯著（P值為0.8268），說明未知因素對發酵液活菌數干擾性小，方程擬合度好。對于模型回歸方程系數的顯著性試驗表明，一次項系數X1、X2、X3，二次項X12、X22、X32和交互項X2X3對發酵液活菌數影響極顯著，交互項X1X2和X1X3可顯著影響發酵液活菌數。綜合表明該模型與試驗值擬合很好，能夠較好地反映菌株E.faecalis EXW27發酵活菌數與攪拌轉速、發酵恒定pH、碳源添加量之間的關系，因此所得的回歸方程能較好地預測E.faecalis EXW27液體高密度培養的活菌數在不同小試工藝條件下的變化規律。

表1 響應面試驗設計及結果

表2 回歸方程的方差分析

固定其中的一個因素，做另外兩個因素交互作用的曲面圖及等高線圖，確定攪拌轉速、發酵恒定pH、初始糖濃度對菌株發酵培養的活菌數含量的影響。由圖6可知，攪拌轉速、發酵恒pH、初始糖濃度兩兩交互作用對乳酸菌數的影響均出現拋物面型關系，所得到的響應面都存在一個極大值點，其中，初始糖濃度和攪拌轉速的交互作用極顯著，攪拌轉速和發酵恒定pH的交互作用較弱。在一定培養時間下，乳酸菌活菌數隨著培養初始糖濃度的上升而呈現上升趨勢，在48 g/L時達到最高值，之后隨著糖濃度升高而呈現下降趨勢。在固定初始糖濃度時，隨著攪拌轉速的增加，乳酸菌數出現先增加后降低的趨勢。

經過響應面優化，根據擬合二階模型公式得到理論上的各因素的最佳培養條件為：發酵恒定pH 5.49、初始糖濃度47.74 g/L、攪拌轉速164.42 r/min。為了驗證響應面模型的有效性，考慮到實際操作的方便性，將各因素修正為發酵恒定pH 5.5、初始糖濃度48 g/L、攪拌轉速165 r/min，在此修正條件下進行3次平行試驗，得出發酵液活菌菌數實際值為33.86×109cfu/mL，與預測值34.94×109cfu/mL較為接近，說明采用響應面法得到的該模型結果較為可靠，具有一定實用價值。

2.3 pH反饋補料分批培養 在pH控制與補料相關聯的補料分批培養過程中，通過反向關聯的方式，以pH為信號來流加葡萄糖液，即當pH大于5.5時啟動補料，反之停止補料。補料前的培養過程，通過流加酸堿使pH保持在5.5。流加模式為加2 s，停10 s，補料分批培養過程中，在發酵開始階段，發酵液的pH降低，蠕動泵自動加入12.5%氨水溶液使發酵過程中的pH維持在5.5，當葡萄糖消耗殆盡之后由于氨基酸的脫氨基作用使pH增加，當pH高于5.5時，補料泵自動加入葡萄糖液。

從圖7可看出，補料發酵的條件下，菌體的對數生長期延長至18 h，顯著提高了發酵液活菌含量，菌體最終濃度在37.99×109cfu/mL以上，比對照組無補料分批發酵最終活菌濃度提高了11.2%，說明pH反饋流加補料發酵方式優于分批發酵方式。這些結果進一步表明，提高碳源添加量是提高發酵液活菌數的有效方法。

3 討論

試驗通過5 L發酵罐發酵糞腸球菌，初步研究糞腸球菌的液體發酵條件，發現氣體環境、攪拌速度、中和劑、發酵恒定pH和初始糖含量等都會不同程度的影響糞腸球菌在發酵罐內的生長。E.faecalis EXW27屬于兼性厭氧菌，對溶氧量要求較為嚴格，因此選擇合適的氣體環境和攪拌轉速對EXW27液體發酵是必要的；乳酸菌培養過程中將培養基的糖類代謝為有機酸，培養后期有機酸大量積累對菌體生長產生抑制作用，為減輕培養過程中高酸環境對菌體生長的抑制，通過流加中和劑使培養液的pH維持在菌體最適生長范圍內可以有效緩解這種抑制作用，從而提高菌體的生長密度。針對不同的微生物或不同培養基質，不同的中和劑所能達到的效果也不盡相同。本研究發現用12.5%氨水控制pH穩定在糞腸球菌EXW27最適生長范圍，可以促進菌體的生長，提高單位體積內的活菌數，原因可能是氨水能中和發酵過程中過多的有機酸，又能為菌體生長提供氮源，因此，解決乳酸菌菌體濃度低的方法有很多，但必須結合工藝過程的整體特點，全方位考慮才能使菌體濃度達到高密度。本研究分析了氣體環境、攪拌速度、中和劑、發酵恒定pH和初始糖含量等對菌體生長的影響，減少代謝產物形成并使菌體以最大生長率達到高密度培養，逐步優化菌體的小試發酵工藝，使得發酵液最終活菌數在37.99×109cfu/mL 以上。

4 結論

本試驗結果表明，糞腸球菌EXW27的小試發酵工藝為：將種子液以3%（V/V）接種于裝液量為70%的5 L小罐，攪拌轉速165 r/min，通空氣保壓0.02 Mpa，自動流加12.5%的氨水控制pH恒定為5.5，當pH高于5.5流加葡萄糖補料發酵18 h，減少代謝物有機酸形成，減輕酸環境對菌體生長的抑制作用，延長生長期，最終發酵液活菌數為37.99×109cfu/mL。