添加枯草芽孢桿菌對桑青貯發酵品質的研究

朱佳文， 李峪鵬， 許禎瑩， 李 娟， 蘇志鵬， 雷春龍，劉瀚揚， 徐麒麟， 陳亞迎， 吳永勝， 曹衍波， 邱時秀*

（1.成都市農林科學院畜牧研究所，四川成都 611130；2.四川農業大學動物醫學院，四川成都 611130；3.四川特驅投資集團有限公司，四川成都 610207）

桑的營養價值非常豐富，其含有20%～30%的蛋白質，2.7%～3.1%的礦物質元素和4.1%～7.4%的維生素及高含量的γ-氨基丁酸。據報道，桑葉還含有蘆丁、槲皮素、異槲皮素、脫氧野尻毒素等天然活性物質（Yoshikumi，1988）。 因此，不僅可以作為藥用保健品，還由于其產量高等因素，目前也被廣泛應用于動物飼料中。

枯草芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌，安全無毒副作用。有研究發現添加枯草芽孢桿菌等菌株青貯后的玉米秸稈色澤和結構與原料相似，霉變程度得到改善，感官評定優良（任付平，2007）。 Shi等（2017）利用枯草芽孢桿菌作為玉米-豆粕的固體發酵菌種發現，發酵后的飼料粗蛋白質含量升高，小分子蛋白質和游離氨基酸提高3倍以上，和糞腸球菌一起飼喂動物可以顯著提高飼料的消化率。發酵過程中添加芽孢桿菌可能在抑制有害細菌生長方面起到關鍵作用，能維持動物腸道微生態系統的平衡，還能刺激胰酶分泌，促進維生素和礦物質的吸收（ás wi，atkiewicz等，2010；Wang等，2009）。

本試驗從桑葉種植地收集土樣，對樣品中的菌株進行分離培養，并通過生化和分子生物學特性的鑒定，篩選出一株枯草芽孢桿菌（命名為BSKC）用于發酵桑青貯飼料，旨在為利用微生物發酵技術生產優質飼料桑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗所用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）來自成都市農林科學院分離鑒定菌株，命名為BS-KC；桑取自成都市農林科學院羊馬科研實驗基地，于2018年7月采收；胰酪胨大豆肉湯培養基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；青貯飼料發酵袋規格為30 cm×40 cm，22絲；生化鑒定管購自海博生物技術有限公司；提取細菌基因組試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；PCR相關試劑購自寶日生物技術有限公司。

1.2 細菌的分離鑒定

1.2.1 細菌的分離 稱取飼料桑周圍土壤100 g，置于裝有900 mL無菌PBS的燒杯中，混勻，即為稀釋10倍的樣品懸液。置于80℃水浴鍋20 min后，取100μL進行倍比稀釋，涂布于TSA平板上，37℃培養過夜。次日，挑取疑似芽孢桿菌單菌落進行16SrRNA鑒定。

1.2.2 形態鑒定 將新鮮菌液固定于載玻片上，經革蘭氏染色后，通過光鏡觀察菌落形態。同時，將新鮮菌液進行倍比稀釋后，涂布于TSA平板，37℃培養16 h，觀察平板上的菌落形態。

1.2.3 分子鑒定 根據引物 27F：5’-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’，1492R：5’ -GGTTA CCTTGTTACGACTT-3’擴增細菌16SrRNA，擴增細菌基因片段大小約為1400 bp；根據B.Subtilis特 異 性 引 物 BS-F：5’-CCAGT AGCCA AGAAT GGCCA GC-3’，BS-R：5’ -GGAAT AATCG CCGCTTTGTGC-3’（Ashe 等，2014），擴增枯草芽孢桿菌基因片段大小為1131 bp。細菌基因組提取參照康為世紀CW0552S產品說明書。PRC反應體系：Premix Taq 10 μL；10 μmol/L Primer-F/R各1μL；基因組1μL；H2O 7μL。PCR反應條件：（1）98 ℃ 5 min；（2）98 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃45 s，循環 30 次；（3）72 ℃ 10 min；（4）4 ℃ ∞。

1.2.4 生化鑒定 使用海博生物技術有限公司的細菌微量生化鑒定管進行分析。

1.2.5 供試菌種的生長曲線 采用常規的微生物培養、活化及擴大培養法。疑似菌落于37℃用TSB或TSA復蘇擴大培養，搖床轉速為180 r/min。次日，取新鮮菌液100μL加入5 mL TSB培養基中，每隔1 h吸取100μL菌液進行倍比稀釋，涂布于TSA平板，置37℃培養計數，另取100 μL菌液進行OD600吸光度檢測。

1.3 青貯桑試驗設計 青貯窖采用青貯飼料發酵袋，將新鮮桑葉和葉柄切成3～5 cm左右，混勻，隨機分為30袋，每袋1000 g。對照組（C組）和處理組 （BS-KC組）每個發酵時間點各3袋，其中，BS-KC組B.subtilis添加量水平為5×106cfu/g桑鮮重，充分混勻，人工壓實后系上袋口，并用膠帶密封，置于室溫發酵。在青貯后第7、14天和28天打開發酵袋，分析青貯飼料各項指標。

1.4 發酵飼料樣品處理 分別在青貯后不同發酵時間點，隨機取出C組3袋和BS-KC組3袋，每袋稱取20 g放入250 mL錐形瓶，加入100 mL去離子水，4℃浸提24 h，先用雙層紗布過濾，再用濾紙過濾，測定pH后，將濾液分裝5管，凍于-20℃冰箱用于氨態氮的測定。將剩余的青貯飼料烘干，稱重，測定pH、干物質、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分、粗纖維和氨態氮含量。

1.5 測定指標及方法 水分含量測定參照GB/T 6435-2006《飼料中水分和其他揮發性物質含量的測定》；粗蛋白質含量測定采用凱氏定氮法，參照GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質測定方法》；粗脂肪含量測定采用索氏提取法，參照GB/T 6433-2006《飼料中粗脂肪的測定方法》；粗灰分含量測定采用灼燒法，參照GB/T 6438-2007《飼料中粗灰分的測定方法》；粗纖維含量測定采用消煮法，參照GB/T 6434-2006《飼料中粗纖維的測定方法》；氨態氮含量利用苯酚-次氯酸鈉比色法測定。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離鑒定結果

2.1.1 細菌的分子鑒定結果 通過引物27F和1492R擴增細菌的16SrRNA，如圖1-A所示，并回收核酸片段進行測序比對分析，疑似單菌落為芽孢桿菌屬。通過特異性引物BS-F和BS-R鑒定菌落疑似為枯草芽孢桿菌，如圖1-B所示。

2.1.2 細菌的形態和生長曲線 疑似單菌落在TSA平板上分離純化后生長良好，菌落粗糙、不透明、擴張、中間有褶皺、微微帶黃色。通過光鏡觀察，該菌落為革蘭氏陽性菌，呈桿狀。通過對BSKC的生長曲線進行繪制，發現新鮮菌液培養8 h之后進入穩定期，細菌OD600值可達1.1（圖2-a），細菌數可達 4×108cfu/mL（圖 2-b）。

2.1.3 細菌的可適生長溫度和pH 由表1可知，BS-KC能在15～75℃內生長，也能在pH為5.5～7.5下生長，說明該BS-KC的生長范圍很廣，耐受能力很強。

表1 枯草芽孢桿菌BS-KC的可適生長溫度和pH

2.1.4 細菌的生化鑒定結果 通過對BS-KC進行糖發酵試驗發現，該菌可以代謝阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖、纖維二糖、山梨醇和蔗糖等，不能代謝乳糖、棉子糖、鼠李糖和木糖等。通過西蒙氏枸櫞酸鹽試驗發現，該菌不能在枸櫞酸鹽中生長。通過H2S測定試驗發現，該菌不能產生H2S氣體。通過明膠測定試驗發現，該菌不能分解明膠。

表2 枯草芽孢桿菌BS-KC的生化試驗鑒定表

2.2 青貯桑營養成分的鑒定

2.2.1 BS-KC對桑青貯過程中pH的影響 由表3可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的pH和對照組無明顯差異。

表3 BS-KC對桑青貯過程中p H的影響

2.2.2 BS-KC對桑粗纖維的影響 由表4可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗纖維含量在發酵第14天后顯著低于對照組。

表4 BS-KC對桑葉青貯過程中粗纖維的影響%

2.2.3 BS-KC對桑粗脂肪的影響 由表5可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗脂肪含量在發酵第14天后顯著低于對照組。

表5 BS-KC對桑青貯過程中粗脂肪的影響%

2.2.4 BS-KC對桑粗灰分的影響 由表6可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗灰分含量和對照組差異不顯著。

表6 BS-KC對桑青貯過程中粗灰分的影響%

2.2.5 BS-KC對桑干物質的影響 由表7可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的干物質含量在發酵第7天后顯著高于對照組。

表7 BS-KC對桑葉青貯過程中干物質的影響%

2.2.6 BS-KC對桑粗蛋白質的影響 由表8可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗蛋白質含量和對照組差異不顯著。

表8 BS-KC對桑葉青貯過程中粗蛋白質的影響%

2.2.7 BS-KC對桑氨態氮/總氮的影響 由表9可知，桑青貯發酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的氨態氮/總氮比值在發酵第7天后顯著低于對照組。

3 討論

3.1 分子試驗結合生化試驗對菌株的分析 發酵被廣泛地應用在生產人類和動物健康的食物上，有研究表明發酵可以提高飼料原料的營養水平，例如棉籽粕、豆粕、干酒槽和木薯殘留物等。目前市場上用于飼料發酵的菌劑主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌。

表9 BS-KC對桑葉青貯過程中氨態氮/總氮的影響g/kg TN

通過細菌通用引物27F/1492R和特異性引物BS-F/R對分離的菌株進行16SrDNA的擴增，初步鑒定該菌為枯草芽孢桿菌，命名為BS-KC。并結合傳統的細菌光鏡觀察、可適生長范圍和生化試驗對其進行鑒定，通過《伯杰細菌鑒定手冊》確定菌株為枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是國家《飼料添加劑品種目錄（2013）》公布的可以用于動物飼養的一種微生物?？莶菅挎邨U菌在青貯玉米的過程中可以不減少飼料營養成分，并且可以改變青貯質量（任付平，2007）?？莶菅挎邨U菌還能發酵玉米-豆粕，使飼料粗蛋白質含量增加（Shitffu，2017）。因此，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑發酵青貯飼料有非常廣闊的應用前景。

3.2 添加枯草芽孢桿菌對青貯桑飼料發酵品質的影響 飼料的干物質、粗蛋白質、粗灰分等指標可用于評價青貯飼料的營養性質；而氨態氮/總氮的比值，則是評估蛋白質破壞程度最有效的指標；pH是衡量青貯飼料品質好壞的重要指標之一。試驗發現經過28 d的青貯桑飼料，BS-KC組和C組的pH變化不大，可能是由于枯草芽孢桿菌對青貯飼料的pH沒有影響，不會像乳酸菌添加劑一樣明顯改變青貯飼料的pH。試驗粗蛋白質的含量變化不大，沒有出現顯著差異，說明該BS-KC對青貯桑的蛋白質含量沒有顯著影響。

本研究篩選的BS-KC可能含有纖維素酶活性和脂肪酶活性。飼料中的粗纖維和粗脂肪被枯草芽孢桿菌大量降解，導致青貯14 d后，BS-KC組的粗纖維和粗脂肪含量明顯低于C組，這可以改善青貯桑的適口性，提高飼料的消化利用率。有研究報道，枯草芽孢桿菌能夠產生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶類，可以分解桑葉中的蛋白質、脂肪、淀粉等，形成動物容易吸收的小分子物質，也可以減少抗營養因子（ANFs）的含量，提高飼料的營養價值（Kiers等，2000）。 Yang等（2016）指出發酵過程中可溶性總糖和粗脂肪含量顯著減少，可能是由于被加入的地衣芽孢桿菌利用，這可能是本試驗中粗脂肪減少的一個原因。同時，枯草芽孢桿菌大量繁殖可產生多種次級代謝產物和菌體蛋白，這可能是干物質含量增加的原因。氨態氮/總氮的比值可反映青貯飼料中氨基酸和蛋白質的分解程度，比值越小，說明氨基酸和蛋白質分解得越少。 當發酵第 7、14、28天，BS-KC 組的氨態氮/總氮的比值均明顯低于C組，說明添加枯草芽孢桿菌之后，青貯桑的質量和飼料的消化利用率明顯提高。

4 結論

本試驗結果表明，在桑葉青貯過程中添加枯草芽孢桿菌BS-KC發酵14 d，飼料中干物質含量略有增加，粗纖維和粗脂肪的含量及氨態氮/總氮比值降低，桑發酵品質得到改善。