響應面優化紅香木樹皮浸泡酒抗氧化活性以及成分分析

張言，高定烽，李思敏，石峰，熊華斌，2，3，*，高云濤，李曉芬，楊志

（1.云南民族大學化學與環境學院，云南昆明650500；2.云南省跨境民族地區生物質資源清潔利用國際聯合研究中心，云南昆明650500；3.民族地區礦產資源綜合利用重點實驗室，云南昆明650500）

紅香樹（Anneslea fragrans Wall）為山茶科茶梨屬常綠喬木，又名豬頭果[1]、紅楣和香葉樹[2]。紅香樹生命力極強，在云南普洱思茅等地的山坡路旁以及雜草從中都可以找到紅香樹。紅香木樹皮研磨成粉末食用可以達到健胃、舒肝、退熱；其樹皮直接煮水食用可以治消化不良、腸炎、肝炎[3]。隨著生活水平的提高，人們對功能食品越來越關注。開始出現利用功能植物的浸泡酒，如瑪咖浸泡酒[4]、魚腥草泡酒[5]等。但紅香木樹皮浸泡酒還缺乏系統報道。

本試驗分別利用紫外分光光度計（ultraviolet spectrophotometer，UV） 和氣相色譜與質譜聯用（gas chromatography coupled with mass spectrometry，GC-MS）對紅香木樹皮浸泡酒的成分以及抗氧化活性進行分析，為進一步開發和利用紅香木樹皮浸泡酒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅香木樹皮采自于云南普洱思茅縣，分布于低緯高原南亞熱帶季風氣候區，樹皮均來自同一棵紅香樹。在試驗中使用的紅香樹樹皮均被粉碎，并且過60目篩子，備用。

95%乙醇（分析純）、DPPH：美國Sigma 公司；實驗室用水為超純水。

1.2 材料與設備

SJIA-2012 超聲波細胞破碎機：寧波雙嘉儀器有限公司；8453 型紫外可見分光光度計：美國安捷倫公司；FA2004 電子分析天平：上海上平儀器公司；HH-4 水浴鍋：力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅香木樹皮提取物最大吸收峰的測定

準確稱取3.0 g 紅香木樹皮干粉，按液固比10 ∶1（mL/g）加入乙醇，置于 60 ℃水浴中萃取 2 h，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，備測。備測樣品均用對應溶劑稀釋50 倍，再進行200 nm～800 nm 的光譜掃描，得到紅香木樹皮溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.3.2 不同體積的乙醇的浸泡物對DPPH 自由基的清除效果

準確稱取3.0g 紅香木樹皮干粉共6 份，分置于6個200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口，按液固比 10 ∶1（mL/g）分別加入體積分數為0%、10%、30%、50%、70 %和95%的乙醇開展試驗，均置于50 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心。取10 mL 配置好的DPPH（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH 自由基的清除率。

1.3.3 不同料液比的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除效果

準確稱取3.0g 紅香木樹皮干粉共6 份，分置于6個200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口，按液固比 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）加入乙醇開展試驗，均置于50 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心。取10mL配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH 自由基的清除率。

1.3.4 不同超聲功率的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除效果

精確稱取3.0 g 紅香木樹皮干粉共6 份，置于6 個200mL 燒杯中，以保鮮膜封口并置液固比為10∶1（mL/g）、50 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設置超聲時間為 20 min，分別超聲提取 150、225、300、375、450、525 W，然后取濾液離心。取10 mL 配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入 0.5 mL 的濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH 自由基的清除率。

1.3.5 不同超聲時間的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除效果

準確稱取6 份3 g 紅香木樹皮干粉，置于200 mL 燒杯中，將瓶口以保鮮膜封口并置液固比為10 ∶1（mL/g）、60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設置超聲功率為 200 W，分別超聲提取 5、10、20、30、40、50、60 min，然后取濾液離心。取10 mL 配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入 0.5 mL 的濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH 自由基的清除率。

1.3.6 中心復合試驗設計（central composite design，CCD）設計及其試驗結果

在探究對DPPH 自由基清除的過程中，適當超聲的引入有利于提高乙醇對紅香木樹皮有效物質的浸出，從而使清除率增加，但大功率的超聲的使用則產生反作用，由此可見，超聲功率是構建紅香木樹皮乙醇浸出物對DPPH 自由基清除的關鍵性因素，故選取超聲功率作為響應面分析的影響因素。此外，在單因素試驗中，一定范圍內的液固比和超聲時間對清除率的影響較為顯著，故將其作為響應面分析的影響因素。因此，采用Expert 8.1.6 軟件中的CCD 法對清除體系中液固比、超聲時間和超聲功率對DPPH 自由基清除率的影響進行探究。根據CCD 設計原理，液固比、超聲時間和超聲功率各設置3 個水平，因素水平表見表1。

表1 響應面優化超聲輔助清除DPPH 自由基試驗的因素與水平值Table 1 Response surface optimization of ultrasound-assisted removal of DPPH free radical test factors and levels

1.3.7 紅香木樹皮泡酒的抗氧化活性分析

準確稱取3 g 紅香木樹皮干粉，置于200 mL 燒杯中，加入30 mL 的色譜級乙醇，在60 ℃水浴中浸提2 h，待測；取 10 mL 配置好的 DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的濾液，待測。

2 結果與分析

2.1 紅香木樹皮提取物最大吸收峰的測定

紅香木樹皮和DPPH 自由基的紫外譜圖見圖1。

圖1 紅香木樹皮和DPPH 自由基的紫外譜圖Fig.1 UV spectrum of Anneslea fragrans Wall.bark and DPPH free radical

由圖1 可知，紅香木樹皮溶液的吸收光譜在400 nm～800 nm 之間并沒有吸收峰，DPPH 溶液在 328、517 nm 處出現2 個較強的特征吸收峰，而紅香木樹皮溶液在218 nm 處出現較強的特征吸收峰。所以本試驗選用的紅香木樹皮溶液的最大吸收波長為218 nm。

不同提取溫度的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除率見圖2。

由圖2 可知，溫度在提取過程中可以分為2 個階段，一是加速提取；二是緩慢提取。在45 ℃～50 ℃之間的紅香木樹皮樹皮的溶液對DPPH 自由基清除率的影響隨溫度的升高而升高，但從50 ℃～65 ℃之間的紅香木樹皮的溶液，隨著溫度的升高清除率緩慢增加，其原因可能是因為在提取過程中溫度慢慢接近于乙醇的沸點溫度78 ℃[6]，一部分乙醇蒸發；還可能是從紅香木樹皮提取出來的物質具有熱敏性，溫度過高導致一些熱敏性成分損失[7]，所以在提取過程中所用溫度均為 50 ℃。

圖2 不同提取溫度的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除Fig.2 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution at different extraction temperatures

不同體積分數的乙醇浸泡液對DPPH 自由基的清除率見圖3。

圖3 不同體積分數的乙醇浸泡液對DPPH 自由基的清除率Fig.3 Removal of DPPH free radicals by different volume fractions of ethanol soaking solution

由圖3 可知，在不同體積的乙醇浸泡液試驗中可以看出0%～50%體積分數的乙醇對DPPH 自由基的清除效果呈明顯上升的趨勢。當乙醇體積分數達到了50%時，紅香木樹皮提取物清除DPPH 自由基的效果達到了最大，當乙醇體積分數達到了95 %時，對DPPH 自由基的清除效果并沒有顯著增加。由此可以認為對于紅香木樹皮提取溶液的選擇是極為重要的，對DPPH 自由基有清除效果的物質不單單是醇溶，也不都為水溶。很多文獻顯示不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力有不同的影響[8-9]。從此試驗中可以得出市場上的適度白酒可以最大化的將紅香木樹皮的有效物質提取出，而且提取過程中單純使用水溶液提取的液體容易霉變，不便于保存。

2.2 不同液固比的紅香木樹皮溶液對DPPH自由基的清除效果

不同液固比的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除率見圖4。

圖4 不同液固比的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除Fig.4 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution with different ratios of material to liquid

由圖 4 可知，在液固比 5 ∶1（mL/g）～15 ∶1（mL/g），清除率隨液固比呈快速上升趨勢，對DPPH 自由基的清除率達到最大值，液固比大于 15 ∶1（mL/g）時，清除率反而隨液固比的增加而顯著變化，這是由于隨著紅香木樹皮干粉質量增加，溶解也在增加，但是乙醇體積有限，溶解能力有限[10]，無法將紅香木樹皮干粉全部溶解，故乙醇溶液已經達到飽和狀態，所以清除率不再有變化。

2.3 不同超聲功率的紅香木樹皮溶液對DPPH的清除效果

不同超聲功率的紅香木樹皮溶液對DPPH 的清除率見圖5。

圖5 不同超聲功率的紅香木樹皮溶液對DPPH 的清除率Fig.5 Clearance of DPPH by Anneslea fragrans Wall.bark solution with different ultrasonic power

超聲功率為150 W～525 W 時的清除率呈整體下降趨勢。相對于超聲功率為450 W～525 W，150 W～450 W時的清除率下降較為緩慢。對這種影響超聲功率的增加，清除率反而有所下降，這可能是由于超聲功率過高，超聲波對紅香木樹皮干粉的組織結構產生了破壞作用[11]，體系中有大量的色素分子，這一部分色素在加入DPPH 自由基的過程中對吸光度有影響，從而造成清除率降低的現象。

2.4 不同超聲時間的紅香木樹皮溶液對DPPH自由基的清除效果

不同超聲時間的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除率見圖6。

圖6 不同超聲時間的紅香木樹皮溶液對DPPH 自由基的清除率Fig.6 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution at different ultrasonic times

由圖6 可知，在 10 ∶1（mL/g）的液固比，200 W 超聲功率的條件下，研究不同的超聲時間下對DPPH 自由基清除的影響。在20 min～30 min 時，隨著超聲時間的延長，清除率呈直線上升趨勢；與20 min～30 min 時相比，隨著超聲時間的延長，30 min～70 min 時提取液的吸光度值較平緩，這可能是由于隨著超聲時間的延長，溶劑體系的滲透壓接近平衡，色素隨著溶劑向細胞外緩慢擴散[12]。

2.5 超聲輔助提取的響應面法優化

2.5.1 CCD 試驗設計及試驗結果

據CCD 試驗設計，以液固比、超聲時間和超聲功率3 個因素作為自變量A、B、C，紅香木樹皮乙醇的浸出物對DPPH 自由基的清除率作為響應值R，通過Expert 8.1.6 分析軟件獲得的試驗方案及其采用該方案獲得的試驗結果如表2 所示。

表2 CCD 試驗設計及試驗結果Table 2 CCD test design and experimental results

續表2 CCD 試驗設計及試驗結果Continue table 2 CCD test design and experimental results

2.5.2 回歸和方差分析

以紅香木樹皮乙醇浸出物對DPPH 自由基清除率為響應值，在響應面分析軟件中對液固比、超聲時間和超聲功率進行回歸擬合，響應值R 清除率與各影響因子間的回歸方程為：

所得模擬方程具有較好的相關性，相關系數為R2=0.988 4。此外，對回歸模型進行了方差分析，結果如表3 所示。

表3 清除DPPH 自由基回歸方差分析結果Table 3 Elimination of DPPH free radical regression analysis of variance results

建立模型的P＜0.000 1，具有極顯著性，失擬項的P＞0.1，無顯著性，由此可見，所建模型可用于清除DPPH 自由基的響應面分析。此外，A、B、C、BC、A2、B2、C2項的P 值均小于0.05，表現出顯著性，這表明固液比、超聲時間和超聲功率均為清除DPPH 自由基過程中影響清除率的主要因素，其中，A、C、C2項的 P＜0.001，即液固比和超聲時間對DPPH 自由基的清除率的影響高度顯著，而B 的P＜0.05，表明超聲功率對DPPH 自由基的清除率的影響效果要明顯弱于液固比和超聲時間。AB、AC、BC 項中，僅有 BC 的 P＜0.01，這表明超聲時間和超聲功率對DPPH 自由基的清除率的影響在一定程度上表現出交互作用，而其他因素間則無此效應。

2.5.3 響應面分析

各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應面見圖7。

圖7 各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the effects of various factors and their interactions on ultrasound-assisted extraction

圖7 顯示了液固比（A）、超聲功率（B）和超聲時間（C）三因素對DPPH 自由基清除率的等高線圖a、圖c、圖 e 和 3D 響應面圖 b、圖 d、圖 f，3D 響應曲面在二維平面上的投影就是等高線圖。由圖7a 可以看出，沿著B因素（超聲功率）向峰值方向移動，其等高線的密度明顯低于沿A 因素（液固比）方向，由此可見，相對于超聲功率，液固比對DPPH 自由基清除率的影響更為顯著。由對應的3D 響應面圖7b 也能獲取相同的結果，在B因素方向，響應面曲線較為平緩，說明超聲功率對DPPH 自由基清除率影響較小，隨超聲功率的增加，清除效果有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著，而沿A 因素方向則出現了較為明顯的變化，響應面曲線較陡，液固比引起清除率的變化較大，說明液固比對DPPH 自由基清除率的影響大于超聲功率。

圖7c 和圖7d 則顯示了A 因素（液固比）和C 因素（超聲時間）對DPPH 自由基清除率的影響。由等高線圖可以看出，沿著C 因素（超聲時間）向峰值方向移動的等高線密度也要相對低于沿A 因素（液固比）方向。由3D 響應面圖則可以看出，在A 因素方向響應面曲線有一定的坡度，但是，在C 因素方向，響應面曲線較為平緩，說明超聲時間對DPPH 自由基清除率的影響較小，隨超聲時間的增加，對DPPH 自由基清除率有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著。由此可見，A 因素變化對結果的影響要高于C 因素，即相對于超聲時間，液固比的影響更大。

由圖7e 和圖7f 可以比較B 因素（超聲功率）和C因素（超聲時間）對DPPH 自由基清除率的影響。由兩因素沿峰值方向的等高線密度及其3D 響應面圖中響應面曲線的陡峭程度可以看出，B、C 兩因素的影響也存在較大差異，相對于超聲功率，超聲時間的影響較弱一些。響應面分析直觀反映了各因素的影響情況，其效果優于單因素試驗，綜合分析可以發現，3 個因素對清除率的影響有所不同，其程度大小為：液固比＞超聲功率＞超聲時間。

此外，通過響應面分析模型對DPPH 自由基清除率條件進行了優化分析，預測的最優條件是液固比為20 ∶1（mL/g）、超聲時間為 21.65 min、超聲功率為232.31 W，預測的最優清除率為95.15%。通過試驗檢驗最優預測條件下的提取效果，清除率與預測值相接近，達到91.6%，相差3.56%。

2.6 紅香木樹皮泡酒的GC-MS分析

紅香木樹皮在色譜級的乙醇中浸泡24 h 的氣相色譜圖見圖8，紅香木樹皮溶液成分分析見表4。

圖8 紅香木樹皮氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of Anneslea fragrans Wall.tree bark

表4 紅香木樹皮溶液成分分析Table 4 Composition analysis of Anneslea fragrans wall.bark solution

從圖8 和表4 中可以看出，從浸泡液中分離出了8 種物質。

本研究采用氣相色譜儀對浸泡液清除DPPH 自由基的成分進行了分析，并利用氣質色譜聯用儀對色譜中出現的各峰進行解析，加入紅香木樹皮后溶液氣相色譜見圖9。

圖9 加入紅香木樹皮后溶液氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of the solution after adding Anneslea fragrans Wall.bark

從圖9 可知，從中分離出4 種物質。

3 結論

經優化后，紅香木樹皮浸泡酒預測的最優條件是液固比為 20 ∶1（mL/g）、超聲時間為 21.65 min、超聲功率為232.31 W，預測的最優去除率為95.15%。通過試驗檢驗最優預測條件下的提取效果，清除率與預測值相接近，達到91.6%，相差3.56%。

紅香木樹皮浸泡酒因紅香木樹皮的特有成分，營養豐富，感官指標良好，風格獨特，具有進一步開發利用的價值。