響應面法優化番木瓜籽蛋白質提取工藝

廖燦杰，楊宏，2，3，*，王玉棟，莊洋

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070；2.湖南文理學院水產高效健康生產湖南省協同創新中心，湖南常德415000；3.華中農業大學環境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

食品工業生產、制備和消費產生大量固體和液體廢物。這些廢物造成潛在的處理和污染問題，同時損失有價值的生物元素和營養物質。而且，由于嚴格的國家國際法規，廢物管理已成為必然。食品加工廢物有可能轉化為有用的產品，甚至作為其他行業的原料。利用水果和蔬菜加工廢物作為提取功能性成分的來源是一個充滿前景的領域[1]。例如最大限度地減少加工操作產生的廢物，對副產品進行處理和處置或者可持續性生產。食品加工殘留物的生物轉化越來越受到關注，因為這些剩余物質有可能轉化為有用產品和可利用的資源[2]。

番木瓜（Carica papaya L.）是一種具有高營養價值和經濟價值的熱帶植物[3]，不僅作為新鮮水果食用、生產果汁或果醬，還被用來提取木瓜蛋白酶、做化妝品；全球年產量達到1122 萬噸，占熱帶水果總產量的15.36%[4]。由于年度消費量高，工業加工中產生的大量番木瓜籽，被認為是廢棄物；據粗略計算，番木瓜籽占番木瓜重量的15%～20%[5]。目前有關番木瓜籽的研究主要集中在油脂和多酚等成分的提取和分析，關于番木瓜籽蛋白質的研究很少。同時，國內鄧楚津等對番木瓜籽基本成分進行分析，發現其蛋白質含量在25%左右；同時與聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織參考模式作對比，番木瓜籽蛋白的氨基酸含量豐富，種類齊全[5]。有關番木瓜籽蛋白質最佳獲取條件的研究很少，因此本文研究了最合適的番木瓜籽蛋白質提取條件，為蛋白質作為食品添加物提供技術支撐。

pH 值、溫度、離子強度、提取時間和液料比等因素對甜瓜籽粕[6]、亞麻籽[7]蛋白質提取均有影響。根據最終用途要求，遵循各種提取、分離和分餾程序。通常，在堿性溶液中提取富含蛋白質的物質，然后進行等電沉淀，應用于食品。響應面法（response surface method，RSM）由一組數學和統計技術組成，這些技術基于經驗模型與試驗設計相關的試驗數據的擬合[8]。當多種因素相互作用影響蛋白質的浸提效果時，響應面法作為一種既能找到最優因素值也能通過圖形技術直觀的反應各因素之間的函數關系，進而獲取最佳優化條件的分析方法[9]，在各類化學物質提取中均有廣泛應用，例如菜籽油[10]、葡萄多酚[11]的提取。

在本研究采用堿溶酸沉法提取蛋白，采用響應面法優化番木瓜籽蛋白質提取條件，為番木瓜籽蛋白質的工業化生產及其深加工提供指導，提升番木瓜籽的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番木瓜：海南水果超市；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國 Roche 上海肯強事業有限公司；考馬斯亮藍G-250：北京蘭杰柯科技有限公司；氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

PB-10 型 pH 計、AL-204 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；K9840 型凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；Beckman Coulter Allegra X-22R 高速冷凍離心機：克曼庫爾特實驗室有限公司；UV-1800 型紫外分光光度計：日本島津公司；GZX-9070 型MBE 數顯鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司；HH-6 型恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

番木瓜籽粉制備：番木瓜籽水中淘洗去除籽粒表面殘余果肉，瀝干水分，40 ℃條件下烘干，高速粉碎機粉碎過80 目篩；采用索氏抽提法脫脂6 h～7 h，重復2次，然后番木瓜籽粉放入通風櫥風干過夜，存于自封袋中，常溫儲存。

1.3.2 番木瓜籽蛋白質提取

采用堿溶酸沉法[12]提取：取10 g 脫脂番木瓜籽粉與去離子水按一定比例混合，在一定溫度條件下用0.2 mol/L NaOH 或 0.2 mol/L HCL 調節 pH 值，攪拌一定時間后將懸浮液在常溫條件下7 000 r/min 離心12 min，收集上清液，并測定上清液中蛋白質含量。

1.3.3 蛋白質含量測定

1.3.3.1 番木瓜籽總蛋白含量測定

采用微量凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

1.3.3.2 番木瓜籽蛋白提取液蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法[13]，標準曲線方程：Y=5.724 1X-0.01，R2=0.996 5

其式中：Y 為吸光度；X 為蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.3.3.3 提取液蛋白質含量測定

取稀釋到適當濃度的提取液1 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍G-250 溶液，在595 nm 處測定吸光值，計算蛋白質的含量。

番木瓜籽蛋白質提取率/%=提取液中蛋白質含量/番木瓜籽蛋白質總含量×100

1.3.4 等電點測定

取20 mL 蛋白提取液，用0.2 mol/L HCL 調至pH值 至 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，靜置2 h，8 000 r/min 離心10 min 后去掉上清液，沉淀在50 ℃烘干30 min 稱重，重復3 次，蛋白質沉淀量最大對應的pH 值即為蛋白質的等電點。

1.3.5 單因素試驗

選取pH 值、液料比、時間、溫度4 個因素作單因素試驗，以番木瓜籽蛋白質提取率為考察對象，考察各因素對蛋白質提取效果的影響。

探究不同 pH 值（8、9、10、11、12）對蛋白質提取率的影響，取10 g 脫脂番木瓜籽粉在液料比30（mL/g）、浸提時間180 min、溫度40 ℃的條件下。

探究不同液料比[10、20、30、40、50（mL/g）]蛋白質提取率的影響，取10 g 脫脂番木瓜籽粉在pH 值為11、浸提時間180 min、溫度40 ℃的條件下。

探究不同時間（60、120、180、240、300 min）對蛋白質提取率的影響，取10 g 脫脂番木瓜籽粉在pH 值為11、液料比 40（mL/g）、溫度 40 ℃的條件下。

探究不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）對蛋白質提取率的影響，取1 g 脫脂番木瓜籽粉在pH 值為11、液料比 40（mL/g）、時間 240 min 的條件下。

1.3.6 響應面試驗設計

利用3 個水平，4 個變量和中心復合設計（central composite response design，CCRD）[14]的統計工具，具有29 個單獨的點，用于研究4 個變量對從番木瓜籽提取蛋白質的影響。基于前面單因素試驗選擇自變量及其水平。

29 次運行以完全隨機的順序進行，以最大限度地減少偏差。每個試驗具有兩次重復，并且將平均提取的蛋白質作為響應值Y。獨立變量及其水平如表1所示。

表1 試驗因素水平和編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

1.3.7 數據分析

用 IBM SPSS Statistics 21、Origin 8.5 進行試驗數據分析和圖表制作，使用Dsign-Expert V8.0 進行響應面試驗設計。每組試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 番木瓜籽蛋白質等電點

不同pH 值下的蛋白質沉淀量見圖1。

圖1 不同pH 值下的蛋白質沉淀量Fig.1 The quality of protein precipitation at different pH

蛋白質分子表面有大量具有不同解離常數的帶電基團，不同pH 值條件下總電荷數就不同。當pH 值為某一特定值，即蛋白質所帶電荷的總和為零時，該pH 值即為該蛋白質等電點。此時，蛋白質會聚集沉淀，而不會變性。由圖1 可知，隨著pH 值增加，蛋白質沉淀量呈先升高后降低。當pH 值在3.0～3.5 范圍時，蛋白質沉淀量較高，此時，蛋白質凈的正、負電荷數總和接近于零，蛋白質-水相互作用降低、蛋白質-蛋白質間靜電排斥作用降低而引發蛋白質聚合沉淀[15]。表明番木瓜籽蛋白質的等電點pH 值在3.0 附近，這與棉籽（pI=4.5）[16]、亞麻籽（pI=5.4）[7]等植物種子蛋白等電點有區別。

2.2 番木瓜籽蛋白質提取單因素試驗

2.2.1 pH 值對蛋白質提取效率的影響

pH 值對番木瓜籽蛋白質提取率的影響見圖2。

圖2 pH 值對番木瓜籽蛋白質提取率的影響Fig.2 The effect of pH value on extraction rate of Carica papaya L.seed

通常情況使用偏堿性的浸提液可以提高蛋白質溶解度，大多數植物蛋白質（如大豆分離蛋白、花生分離蛋白、奇亞籽分離蛋白）都屬于偏酸性的蛋白質。由于番木瓜籽蛋白質等電點為3.0，在堿性環境中蛋白質呈負電性，進而導致蛋白質-蛋白質之間斥力升高；且蛋白質表面的親水基團暴露，加強其與水分子的結合，提高溶解度。探究單因素pH 值對番木瓜籽蛋白質提取率影響由圖2 可知，pH 值對蛋白質提取率影響效果顯著；pH 值在8～11 范圍內，蛋白質提取率與pH值呈正相關；在 pH 值 10～12 范圍內，pH 值為 11 時達到最高值，但該范圍內蛋白質提取率變化浮動較小。

一般來說，在較小的pH 值條件下，蛋白質酸式解離效果不佳，在水溶液中分散性較低，蛋白浸出效果不佳。但pH 值相對較大時，提取液的顏色加深，影響蛋白質產品的視覺感官，從色澤考慮作為食品添加物也不合適；同時pH 值過高會導致，浸提液黏度變大，影響蛋白質酸沉效果，降低得率；而且由于番木瓜籽中碳水化合物含量較高，過堿的環境可能誘導蛋白質結構發生一定程度的變化，促使美拉德反應的發生，不僅導致必需氨基酸損失，還可能會有異味物質和有毒縮合氨基酸產生[17]，影響蛋白質健康的食用。綜合考慮，響應面優化pH 值得選定范圍為10～12。

2.2.2 液料比對蛋白質提取效率的影響

液料比對番木瓜籽蛋白質提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對番木瓜籽蛋白質提取率的影響Fig.3 The effect of liquid-solid ratio on extraction rate of Carica papaya L.seed

蛋白質提取過程中，提取液體積減少會降低蛋白質分子的擴散速率和溶解度；在一定范圍內，蛋白質溶解量會達到一種平衡，類似于溶液的飽和狀態；過高的浸提液體積會導致溶液分散性加大，不利于蛋白質沉淀獲取，同時也浪費水資源和提取液排放造成污染環境。為了獲取最佳的液料比條件，觀察圖3 可發現，蛋白質提取率因液料比的不同而差異明顯。液料比在 10（mL/g）～40（mL/g）范圍里，蛋白質提取率顯著上升；這是由于料液比較小時，溶液黏度較大，分子擴散速度慢，溶液達到飽和時可以溶解的蛋白質量較低；隨著料液比增大，溶液中分子擴散和碰撞速率加快，促進蛋白質分子的溶解。當液料比增加到50（mL/g），較 40（mL/g）提取率反而降低且料液比的增大，蛋白質分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質；同時一些可溶性雜質（如多糖等）溶解性增加不利于獲得純度較好的蛋白質[18]。綜合考慮水資源和獲取率，液料比的最佳條件在40（mL/g）左右。

2.2.3 時間對蛋白質提取效率的影響

時間對番木瓜籽蛋白質提取率的影響見圖4。

圖4 時間對番木瓜籽蛋白質提取率的影響Fig.4 The effect of time on extraction rate of Carica papaya L.seed

在特定條件下，蛋白質的浸出需要一定時間達到平衡狀態；時間較短，分子擴散效率一定，蛋白質溶出量有限；時間過長，可能有更多非蛋白質成分浸出，從經濟性考慮時間成本增加不利于工業生產。研究圖4發現，時間對于蛋白質提取率的影響較顯著，呈先上升后降低的“倒V”型。時間在60 min～240 min 之間時，蛋白質溶出量逐步增加，在240 min 左右蛋白質在溶液中溶解量趨于飽和，處于平衡狀態。延長浸提時間蛋白質提取率呈降低的趨勢，由于蛋白質長時間在堿性環境中會發生輕微水解和變性，而且時間增加，耗能也會增長，生產成本相應也會變大，不利于蛋白質工業化生產；時間延長也會增加非蛋白物質（如糖類、多酚等）浸出，溶于浸提液，影響蛋白質進一步沉淀和蛋白制品純度[19]。因此選取時間為240 min 左右為宜。

2.2.4 溫度對蛋白質提取效率的影響

溫度對番木瓜籽蛋白質提取率的影響見圖5。

圖5 溫度對番木瓜籽蛋白質提取率的影響Fig.5 The effect of temperature on extraction rate of Carica papaya L.seed

溫度的提升可以加快分子擴散速率和分子碰撞概率，促進蛋白質分子的溶出，同時可以降低提取液的粘度，有利于提高蛋白質得率；但溫度超出一定范圍會引起蛋白質結構的發生不可逆的變化和氨基酸損失，降低其營養價值[20]。從經濟性考慮，提升溫度也會損耗更多的能源。溫度對番木瓜籽蛋白質提取率的影響見圖5，在20 ℃～50 ℃范圍內，蛋白質提取率呈升高趨勢，溫度提高，分子運動速率加快，分子之間的碰撞加快，蛋白質分子溶出量增加；溫度的上升也會促進蛋白質表面結構發生輕微改變，利于蛋白質與水之間的相互作用，進而從番木瓜籽粉中浸提出來進入提取液。當溫度繼續升高，蛋白質提取率出現下降的趨勢，較高的溫度會誘導蛋白質結構發生變化，破壞蛋白質分子表面側鏈基團與水相互作用的平衡，導致蛋白質與蛋白質之間發生聚集，增加浸提液粘度，對蛋白質溶出不利[21]。因此蛋白質提取溫度選取在50 ℃。

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗結果及方差分析

該研究利用RSM 模擬出一種預測模型，用于優化從番木瓜籽中提取蛋白質的條件。試驗條件和試驗設計的相應響應值如表2 所示。分析獨立變量和因變量以獲得可預測給定范圍內響應的回歸方程和方程中系數的值如表3 所示。蛋白質提取的回歸方程（Y）如下：

表2 基于Box-Behnken 設計的試驗和預測值Table 2 Experiments and predictions based on Box-Behnken design

續表2 基于Box-Behnken 設計的試驗和預測值Continue table 2 Experiments and predictions based on Box-Behnken design

表3 回歸方程方差分析和顯著性檢驗表Table 3 Regression equation analysis of variance and significance test

如表3 所示，對于一個擬合的模型，確定系數（R2）用來度量適合度[22]，其值為0.942 6。這意味著94.26%的變化可以通過擬合模型來解釋。Gupta 和Kabe 認為，如果模型的擬合良好，R2應該至少為0.80[22]。回歸模型顯著性的P 值小于0.000 1。因此，該擬合模型可以充分代表所選參數之間的真實關系。

通過擬合二階多項式的回歸系數，可以得到番木瓜籽的處理條件對蛋白質提取的影響。顯然，pH 值和液料比的線性項為極顯著（P＜0.01），一個二次項（pH值和液料比）為顯著（P＜0.05），而其他因素及交叉項均無顯著性（P＞0.05）。結果表明，pH 值和液料比的影響是從番木瓜籽中提取蛋白質的主要因素。然而，在試驗范圍內，時間和溫度對番木瓜籽蛋白質提取沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.3.2 自變量對響應值的影響

繪制三維表面圖以說明自變量對依賴變量的主要和交互作用[23]。通過施加恒定值（即，考慮到一個獨立變量的間隔的中心點）來繪制這些圖。二維圖即等高線圖，其形狀（圓形或橢圓形）表明變量之間的相互作用是否重要；若為圓形等值線圖，則表明相應變量之間的相互作用可忽略不計，而等高線圖的橢圓或鞍形則表明變量之間的相互作用顯著[23]。為了更顯著的觀察不同因素對蛋白質提取率的影響，研究圖6 中三維表面圖和二維等高線圖。

圖6 自變量對蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots of independent variables on protein extraction rate

圖6（a）是pH 值和液料比對蛋白質提取率的影響趨勢均是先增加后下降且影響顯著（P＜0.01）。可能是因為適當的pH 值利于蛋白質的浸提，而過大的pH值誘導蛋白質結構發生輕微變化，可能促使美拉德反應，影響蛋白質得率；適當的液料比可以最大化的溶出蛋白質，降低溶液粘度，利于蛋白質沉淀提高得率。由圖6（b）可知，pH 值對提取率的影響效果較時間影響更為顯著，且觀察表3 發現兩個變量的相互作用對蛋白質提取率影響不顯著（P＞0.05）。已經報道了對脫脂蘿卜籽、鷹嘴豆和豌豆蛋白質提取物的提取時間對蛋白質產量的影響的類似報道[24-26]。圖6（c）是料液比和溫度兩個自變量對蛋白質提取率的影響效果與pH值和時間的趨勢類似，液料比影響效果顯著優于溫度；觀察表3 可知，兩個自變量（液料比和溫度）相互作用對于蛋白質提取率的影響效果不顯著（P＞0.05）。

有關番木瓜籽蛋白質的提取報道較少；然而，已經有報道使用其他植物材料的類似研究。Mechmeche，Manel 采用響應面法優化番茄籽蛋白質的提取工藝，發現時間，溫度，pH 值和液料比對蛋白質提取率都有影響，并得出最佳提取條件為pH 8.0，時間30 min，溫度50 ℃，液料比 8（mL/g）[27]。對亞麻籽[7]和木豆[28]蛋白的研究與本研究一致，隨著液料比和pH 值的增加，蛋白質產量明顯增加，而溫度和時間影響沒有那么顯著。

2.3.3 蛋白質優化條件的試驗驗證

使用推薦的最佳條件[（pH 11.3、料液比1∶45（g/mL）、時間224 min、溫度47.5 ℃]測試模型方程對于預測最佳響應值的適用性。通過RSM 優化方法模擬出這組最佳條件進行試驗驗證，并使用模型方程得出預測響應值。預測番木瓜籽蛋白質提取率為55.21%，在此試驗條件下，驗證試驗結果平均值為53.74%，發現試驗值與預測值基本一致。對比王標詩等正交優化試驗結果48.53%，有一定程度的提高[29]。

3 結論

采用響應面法中心復合設計建設的數學模型失逆項不顯著和R2值為94.26%，可使用該方程模擬優化蛋白質提取條件。通過29 種pH 值、液料比、溫度、時間組合優化之后，模擬得到最佳提取條件：pH 11.3、液料比 45（mL/g）、時間 224 min、溫度 47.5 ℃，番木瓜籽蛋白質提取率為53.74%，與理論值55.21%差異不明顯。綜合考量產品得率和外觀，最終確定優化條件為：pH 11、液料比 40（mL/g）、時間 220 min、溫度 47 ℃。因此，可使用中心復合設計對堿溶酸沉法提取番木瓜籽蛋白質進行工藝參數優化，為提升番木瓜籽蛋白質利用價值提取提供理論支撐和依據。