正交試驗設計在茶葉鐵、鋅、銅含量測定中的應用

鄧波，王莎，吳漢奇

（1.川北醫學院預防醫學系，四川南充637000；2.岳池縣人民醫院，四川岳池638300）

茶葉在我國具有悠久的歷史，是國人喜愛的天然飲品之一。近年來，隨著人們生活水平和認知水平的提高，人們也日益關注茶葉的質量，茶葉的營養與安全問題已成為目前老百姓關注的熱點之一。

鐵、鋅、銅均是人體必不可缺的微量元素，是人體的重要組成成分，對人體的健康起著不可忽視的重要作用。但是當其的攝入過低或過量的時候，就會對人體健康造成一定的不良影響，對人體產生傷害。所以，對茶葉中的鋅、鐵、銅元素的檢測可以了解茶葉中相關金屬元素的含量，對人們的健康具有現實意義。根據國家標準GB 5009.90-2016《食品安全國家標準食品中鐵的測定》[1]、GB 5009.14-2017《食品安全國家標準食品中鋅的測定》[2]，和GB 5009.13-2017《食品安全國家標準食品中銅的測定》[3]，對食品中鐵、鋅、銅的測定方法主要有：電感耦合等離子體質譜法、火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體發射光譜法。采用火焰原子吸收光譜法測定鐵、鋅、銅含量，具有靈敏度高、準確性好、方法簡單、結果精確等優點[4-5]。同時，微波消解技術是最近幾年新興的一種高效的樣品前處理技術，是目前應用較多的一種方法。因其具有耗時短、消解徹底、能快速處理大量樣品、且準確度高等優點[6]，近年來被廣泛應用。然而影響微波消解效果的因素很多，如樣品的種類、消解劑的種類及含量、消解壓力、爬坡時間、功率等。并且微波消解條件的設置是否合適，與樣品前處理的效果直接相關，且影響著樣品中金屬元素檢測結果的真實性和可靠性。正交試驗設計正是利用一套規格化的正交表安排試驗，能在多試驗條件中選出代表性強的少數試驗方案，通過對這些少數試驗方案結果的分析，從中找出最優方案，此法已被廣泛應用[7-11]。因此，本研究通過正交試驗設計對茶葉中鐵、鋅、銅含量測定的微波消解條件進行優化，建立火焰原子吸收光譜法準確測定茶葉中鐵、鋅、銅含量的最佳前處理方法，為相關部門對茶葉中微量元素的檢測提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌茶葉：市售；1 000 μg/mLFe 標準溶液、1 000 μg/mLZn 標準溶液、1 000 μg/mLCu 標準溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸（電子級）：蘇州晶瑞化學股份有限公司；過氧化氫（優級純）：美國默克公司。

1.2 儀器及設備

VCD 酸蒸清洗儀：德國安東帕公司；Titan MPS 微波消解儀、PinAAcle 900T 原子吸收光譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；GHP400P 智能控溫電熱板：奧普勒公司；FA114 電子分析天平：上海豪晟科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗前準備

利用酸蒸清洗儀對試驗所用的器材清洗干凈，備用；超市隨機購買某品牌茶葉，研磨備用。加標液的制備：分別吸取1000μg/mL 鐵標準溶液10 mL，1 000 μg/mL的 Zn 標準溶液 3 mL，1 000 μg/mL 的 Cu 標準溶液4 mL 于100 mL 容量瓶中并用純凈水定容、搖勻，即得混合標準儲備液，用于消解開始前對樣品進行加標。

1.3.2 單因素試驗

參考已發表的有關茶葉中微量元素測定的文獻[12-14]，選取適宜的前處理條件進行試驗。試驗針對微波消解中影響消解效果的關鍵步驟中的各條件進行，分別稱取茶葉樣本0.3 g 左右，置于消化罐中，分別采用硝酸含量（2、4、6、8、10、12 mL）、溫度（140、150、160、170、180、190 ℃）、消解壓力（30、40、50、60、70、80 bar）和保持時間（10、15、20、25、30、35 min）對樣本進行消解，通過對其中的Fe、Zn、Cu 進行檢測，以加標回收率來判斷硝酸消耗量、消解溫度、消解壓力和保持時間對消解效果的影響。

1.3.3 正交試驗

根據單因素試驗的結果，確定樣品前處理中的硝酸含量、溫度、消解壓力、保持時間為4 個研究因素，根據正交試驗設計中的L9（34）正交表設計試驗，對樣品進行微波消解，消解完成并進行趕酸處理后應用火焰原子吸收光譜儀測定消解液的分光光度值。通過鐵、鋅、銅的系列標準溶液繪制標準曲線，然后根據標準方程及所測得的消解液的分光光度值計算消解液中鐵、鋅、銅的含量。以加標回收率為評價指標，得出最佳前處理條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels of digestion

1.3.3.1 樣品前處理

取7 個微波消解罐分別編號0 號～6 號，其中0 號為空白對照，使用電子分析天平準確稱取茶葉樣品0.3 g 左右，分別置于1 號～6 號微波消解罐中，按正交試驗設計所設計出的條件分批逐一消解樣品。量取一定體積的硝酸于7 個消解罐中，混勻，靜置5 min 左右使硝酸與樣品進行初步反應后，再向每個消解罐中加入 2 mL 過氧化氫，靜置 5 min，然后向 2、4、6 號 3 個消解罐中加入0.5 mL 上述混合標準儲備液，蓋緊消解罐內蓋置入微波消解儀中，按照設定程序進行消解，其中消解共分為3 個步驟，本試驗采取的方法為固定步驟1 和步驟3，對影響消解效果的關鍵步驟（步驟2）進行試驗條件的調整，表中步驟2 中待定程序按表1 設定。消解程序完成后，取出消解罐將消解液移入燒杯中，并用純凈水清洗消解罐內蓋及消解罐3 次～4 次一并倒入燒杯中，趕酸后，將其多次洗滌并轉移至50 mL容量瓶中，并用純凈水定容，搖勻，即得樣本液，待測。微波消解的升溫程序見表2。

表2 微波消解升溫程序Table 2 The heating process of microwave digestion system

1.3.3.2 儀器工作條件

本次試驗的原子吸收光譜工作條件見表3。

表3 儀器工作條件Table 3 Working coitions of atomic absorption spectrometry

1.3.3.3 標準溶液的制備

取鐵、鋅、銅的標準溶液配置一系列標準溶液。取1 000 μg/mL 的鐵標準溶液稀釋至50 mg/L，分別取1、2、3、4、5 mL 于 100 mL 容量瓶中并用純凈水定容，得到鐵的系列標準溶液。取1 000 μg/mL Zn 標準溶液稀釋至 25 mg/L，分別取 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mL 于 100 mL 容量瓶中并定容，得到鋅的系列標準溶液。取1 000 μg/mL的銅標準溶液稀釋至 25 mg/L，分別取 0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mL 于100 mL 容量瓶中并用純凈水定容，得到銅的系列標準溶液。

1.3.3.4 測定元素含量

以純凈水作為試劑空白與標準空白，使用火焰原子吸收光譜儀測定上述系列標準溶液和待測樣液的吸光度值。根據所得的標準曲線及標準方程，求得待測樣液中鐵、鋅、銅的含量。

1.4 數據處理

本次試驗數據錄入EXCEL13.0 中，運用公式計算得出均數和極差。

2 結果與分析

2.1 標準方程及相關系數

原子吸收光譜儀按照表3 條件下工作，測定標準溶液，最終測得Fe、Zn 和Cu 的標準方程分別為y=0.084 90x+0.000 65（r2=0.999 5）、y=0.685 89x+0.000 42（r2=0.999 8）和 y=0.198 5x+0.001 1（r2=0.999 8）。由此可知微量元素Fe、Zn、Cu 的線性關系及相關性較好。

2.2 單因素試驗結果

單因素試驗結果表明，就硝酸的消耗量來看，Fe，Zn 和Cu 的加標回收率最好的硝酸消耗量分別是6、6、8 mL。就溫度的影響來看，Fe，Zn 和 Cu 的加標回收率分別在190、190、180 ℃為最高。就消解壓力的影響來看，Fe，Zn 和 Cu 的加標回收率分別在 50、60、60 bar時最高。就保持時間的影響來看，Fe，Zn 和Cu 的加標回收率均在20 min 時最高。

2.3 正交試驗結果

以加標回收率作為評價指標，所得正交試驗檢測結果見表4。

在表4 中，Ki代表任何一列水平號為 i（i=1，2，3）時所對應的回收率均數之和，K1、K2、K3則表示任何一列水平號為i（i=1，2，3）時所對應的平均回收率均數；極差R 表示任何一列中K1、K2、K3中的最大值和最小值的差值。因為極差R 的值越大，則對應的因素影響力越大，通過極差分析結果可知：對于微量元素鐵而言，影響微波消解效果的因素依次為硝酸含量、消解壓力、保持時間和溫度；對于微量元素鋅來說，微波消解過程中保持時間是最重要的因素，其次為溫度，然后是硝酸含量，最后是消解壓力。Ki值的大小表示所選擇的每個因素的3 個不同水平對試驗結果的影響力大小，其值越大，則影響力越大。因此，對于微量元素鐵，微波消解的最佳組合方案為A2B3C2D2，即硝酸含量6 mL、溫度 190 ℃、消解壓力 50 bar、保持時間 20 min；對于微量元素鋅，其最優前處理條件為：A3B3C2D3，即為硝酸含量8 mL，溫度190 ℃，消解壓力50 bar，保持時間25 min。對于銅，影響微波消解效果的因素順序是溫度、保持時間、硝酸含量以及消解壓力，其微波消解優化組合是A3B2C3D1，即：硝酸含量8 mL，溫度170 ℃，壓力60 bar，和保持時間15 min。

2.4 驗證試驗

準確稱取茶葉樣本0.300 0 g，共6 份，在本試驗所得的3 種元素的最佳前處理條件下進行驗證試驗，分別得到 Fe、Zn、Cu 的加標回收率平均為 99.73 %，98.91%和100.02%，與趙永福[4]的結果比較，回收率和精密度均較優，說明本文的結果方法可取。

2.5 精密度與檢出限測定

Fe、Zn、Cu 精密度測試時分別選擇濃度為 1.5、0.45、0.8 mg/L 的標準溶液，分別連續測定7 次即可得出該元素的精密度。測試結果顯示：Fe、Zn、Cu 的相對標準偏差分別時0.25%、0.11%和0.2%。檢出限測試時使用試劑空白連續測定11 次即得。結果顯示：Fe、Zn、Cu 的檢出限分別為0.014 1、0.001 3、0.0030 2 mg/L。3種元素的相對標準偏差和檢出限均在儀器允許的誤差范圍之內，說明火焰原子吸收光譜儀在該工作條件下，檢測的準確可靠性高，重復性好，精密度也較高。

3 結論與討論

預試驗階段，在樣本的前處理準備時，消化液的加入量和加入速度需要特別注意。由于本次試驗所用的樣本為茶葉，研磨后為一種輕質粉末，在加入雙氧水和硝酸后，會因為反應而產生類似沸騰的現象，樣本反應太迅速，導致產生的氣體帶著樣本液體直接溢出消解罐，影響消解效果。此現象可以通過增加硝酸和雙氧水加入的時間間隔來解決，本次試驗，我們使用的時間間隔為2 min，有效的避免了樣本損失。

陳文生等[15]在用正交試驗法測定茶葉中的微量元素時得出結果表明：對于元素鈣，其影響因素依次為消解液的體積比（HNO3/H2O2）、消解時間、消解液的用量，最佳前處理方案是HNO3/H2O2的體積比為2 ∶1，消解時間為105 min，消解液用量10 mL。趙欣等[16]通過對陳醋中的幾種微量元素的同時進行正交試驗分析，以尋求最佳前處理方法。本試驗通過正交試驗設計，得到影響微量元素鐵的因素從高到低依次為硝酸含量、消解壓力、保持時間和溫度，其微波消解的最佳組合方案為硝酸含量6 mL，溫度190 ℃，消解壓力50 bar，保持時間20 min；對于微量元素鋅來說，微波消解過程中保持時間是最重要的因素，其次為溫度，然后是硝酸含量，最后是消解壓力，其最優消解條件為硝酸含量8 mL、溫度 190 ℃、消解壓力 50 bar、保持時間 25 min；影響Cu 微波消解效果的因素順序是溫度、保持時間、硝酸含量以及消解壓力，最佳前處理條件組合是為硝酸含量8 mL，溫度170 ℃，消解壓力60 bar，和保持時間15 min。經過優化后的微波消解法較之傳統的試驗條件的選擇和更換來說，具有消解迅速、徹底、準確度高、精密度好高效、污染環境小等特點，適宜在試驗條件的優化中推廣應用。

本試驗通過使用正交試驗設計優化后的前處理條件進行微波消解，減少試驗次數，提高試驗效率，增加了試驗準確性，在今后的研究中，可考慮多種方法的聯合使用[17-18]，以增強試驗的效率。本次試驗所用的各種前處理方法條件，均能將樣本有效的消解，花費時間短，消耗的試劑少，適用于所有茶葉中Fe、Zn、Cu含量的測定，所得出的結果可為有關檢測部門對茶葉的測定提供參考依據，具有比較重要的實踐意義。