槲皮素衍生物合成及其抗氧化性研究

陳佳琪，杜曉倩，范雪毅，周琛凱，饒桂維，王 磊

( 1.杭州師范大學 錢江學院，浙江 杭州 310018；2.浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015 )

1 研究背景

槲皮素(Quercetin，Qe)，化學命名為 3,5,7,3',4'-五羥基黃酮，屬于黃銅醇類化合物[1]。具有心血管保護[2-3]、抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7-10]和抗血小板聚集[11-12]等生物活性。目前，對于槲皮素的應用越來越多，對其的衍生物合成方面也有很多的研究。但大多都是用聚乙二醇將槲皮素進行包埋。我們的研究擬對槲皮素進行結構修飾，與聚乙二醇(PEG-2、PEG-4、PEG-6、PEG-1000、PEG-10000)進行合成，運用化學的方法將聚乙二醇連接到槲皮素的其中一個羥基上，可得到水溶性更高、分子量更大、生物利用度高、生物活性好的產物，其在體內的停留的時間更久，發揮藥效時間更長。

2 研究方法

2.1 儀器與試劑

儀器：高效液相分析HPLC(島津LC-20A)、高速逆流色譜HSCCC(TBE300C)、 旋轉蒸發器(RE 52-99A上海亞榮生化儀器廠)、紅外光譜儀(德國BRUKER公司)、TJ270-300紅外分光光度計、UV-2600紫外可見分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)。

試劑：槲皮素，無水碳酸鈉，PEG-2(PEG-4、PEG-6、PEG-1000、PEG-10000)，DMF，氯仿(分析純)，甲醇(分析純)，濃硫酸(分析純)，薄層層析硅膠(化學純)，正己烷，乙酸乙酯，無水乙醇，色譜甲醇，氯乙酸酐。

2.2 槲皮素衍生物合成

式1中PEG也或與其它位置的羥基進行反應

The PEG in Formula 1 may also be reacted with a hydroxyl group in other locations

用電子天平取0.10g槲皮素于干燥無水帶有磁子的三頸燒瓶中，加入8.0mL DMF和0.0967g無水碳酸鈉，三頸燒瓶先抽真空再充滿氮氣，本次反應在氮氣保護環境下進行，在磁力攪拌的情況下反應1h后加入3.0mL PEG-4,同樣在氮氣保護環境下反應4h后得到槲皮素衍生物，反應期間每2h取1.0mL定容到100mL用高效液相色譜儀進行檢測是否反應得到槲皮素衍生物。如圖2-1(PEG-4反應1h)和2-2(PEG-4反應4h)。

圖1 PEG反應1h

圖2 PEG反應4h

2.3 溶劑體系選擇

選擇使用正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、蒸餾水進行溶劑體系的配比，見表1。

表1 實驗選擇的溶劑體系

本次高速逆流色譜所需的溶劑體系在經過多次高效液相色譜法的檢測后，最后決定使用正己烷：乙酸∶乙酯∶無水乙醇∶水=0.8∶1∶1∶1.2，此時上相：下相=1.3335。上下相峰面積分別如圖圖3、圖4。

圖3 上相液相色譜圖

圖4 下相液相色譜圖

2.4 槲皮素衍生物分離

將帶有無水碳酸鈉、DMF的槲皮素衍生物通過砂芯漏斗過濾除去衍生物中少量無水碳酸鈉，再通過旋轉蒸發儀進行蒸發有機溶劑DMF，最后用真空耙式干燥機對旋蒸后的產物進行烘干得到粉末狀槲皮素衍生物。最后在經過高速逆流色譜儀進行分離提純得到較為純凈的槲皮素衍生物，得到圖5。

圖5 槲皮素衍生物高速逆流色譜圖

2.5 槲皮素衍生物抗氧化性檢測[13]

抗氧化性檢測采用的是DPPH法，其溶液在 517 nm 處有最大吸收值，且與濃度呈線性關系。抗氧化劑能夠結合或替代 DPPH，使溶液吸光度變小，以1mL樣品與3mL無水乙醇混合后溶液作為空白對照，測得吸光度Ao。以1mL無水乙醇代替槲皮素衍生物溶液，測得吸光度 As。通過檢測 517 nm 的吸光度值計算物質的抗氧化能力，測得517nm處的吸光度Ay。并按如下公式計算 DPPH 自由基清除率：

Ay：1mL 樣品溶液與 3mL DPPH 溶液混勻后的吸光度值；As：1mL 無水乙醇與 3mL DPPH 溶液混勻后的吸光度值；Ao：1mL 樣品溶液與 3mL 無水乙醇混勻后的吸光度值。

3 實驗結論與分析

表2 槲皮素衍生物產量隨時間變化

表2(續)

根據表格2實驗數據得到槲皮素與PEG-4的槲皮素衍生物的產量較多。

4 結論

實驗將槲皮素分別與PEG-2、PEG-4、PEG-6、PEG-1000以及PEG-10000反應，經高效液相色譜儀檢測峰面積后發現槲皮素與PEG-4得到槲皮素衍生物的峰面積得到的產量較多，且在4h時得到的產物更多，4h之后會發生副反應，使產物減少。同時，分離產物需要在2h內，否則產物氧化，槲皮素衍生物的峰面積下降，雜質含量大大增加。