水溶性熒光探針的合成及對亞硫酸氫根和pH值的雙重檢測

戚少龍 杜建時* 李容杭 李 強 祝錄寶 時亞男王欣宇 楊清彪* 張桂榮 李耀先

1(吉林大學中日聯誼醫院, 吉林省淋巴外科重點實驗室, 吉林省淋巴外科工程實驗室, 長春 130031)2(吉林大學化學學院, 長春 130061) 3(吉林大學生命科學學院, 長春 130061)4(吉林大學第二醫院, 長春 130041)

1 引 言

SO2是主要的大氣污染物之一，被吸入人體后很快轉化成亞硫酸(氫)鹽，引起眼、鼻、口腔粘膜等刺激癥狀，嚴重者還會引發呼吸道炎癥、缺氧性肺動脈高壓、肺癌和許多神經系統疾病[1～3]。同時，作為SO2的主要衍生物，亞硫酸(氫)鹽是重要的抗氧化劑和防腐劑，廣泛用于食品、藥品、酒水、化妝品中，進入人體會引發多種疾病，被世界衛生組織和國際癌癥研究機構列為第三類致癌物，聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織建議，人體內亞硫酸氫鹽水平應低于0.7 mg/kg[4]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Bruker AV-400MHz型核磁共振波譜儀(四甲基硅烷(TMS)為內標)、Bruker Agilent 1290-micrOTOF QII型質譜儀器(瑞士Bruker儀器公司); Hitachi F-4500型熒光光譜儀、Hitachi U-3010型紫外-可見吸收光譜儀(日本日立公司); X-5型顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司); PHS-3C型數顯酸度計(上海雷磁儀器廠); LX-100手掌型離心機(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司); CO2細胞培養箱(美國Thermo 公司); OPTEC.BDSZW-PH倒置顯微鏡(重慶奧特公司); 超純水制備系統(四川優普超純科技有限公司); 精密電子天平(賽多利斯儀器系統有限公司); LSM710激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。

2,3,3-三甲基吲哚、1,3-丙磺酸內酯、苯甲醛、對羥基苯酚、4-羥基-1-萘甲醛等試劑均購自安耐吉化學試劑公司; 其它溶劑及無機鹽均為市售分析純試劑。96孔細胞培養板(無錫耐思生物科技有限公司); 一次性濾器(美國Millipore生物公司); 細胞培養瓶(康寧生命科學有限公司); Hela細胞(吉林大學生命科學公共技術中心); DMEM(dulbecco's modified eagle medium)高糖培養基(美國Gibco公司); 特級胎牛血清(Biological Industries公司); 胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司); 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT, 美國Amresco公司); 細胞培養皿(無錫耐思生物科技有限公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 探針的合成探針ISND的合成: 將化合物1(0.56 g， 2 mmol)、4-羥基-1-萘甲醛(0.41 g， 2.4 mmol)溶于乙醇，回流攪拌24 h，待反應完成后，冷卻到室溫，過濾得紅色固體，柱層析分離(二氯甲烷-甲醇, 20∶1，V/V)， 得紫色固體0.61 g，即為分子探針ISND，產率67%。1H NMR (400 MHz, DMSO)δ7.92 (ddd,J=29.8, 24.4, 7.3 Hz, 5H), 7.63 (dd,J=10.0, 5.5 Hz, 4H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.82 (s, 1H), 4.69～4.62 (m, 2H), 2.16 (dd,J=15.5, 8.3 Hz, 2H), 1.87 (s, 2H), 1.53 (s, 6H)。13C NMR (101 MHz, D2O)δ183.12, 169.06, 166.29, 141.55, 139.02, 136.01, 129.09, 120.03, 116.44, 96.32, 57.42, 47.81, 47.38, 28.16, 22.17, 16.84。ESI-MS (m/z): [M+H]+calcd for [C25H25NO4S]+, 436.1577; Found, 436.1562(詳見電子版文后支持信息圖S1～S3)。探針ISBD和ISPD的制備方法類似(具體合成過程見電子版文后支持信息示意圖 1，相關化學表征核磁H譜、C譜、高分辨質譜見電子版文后支持信息圖S4～S11)。

2.2.2 溶液的配制磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制: 稱取1.79 g Na2HPO4、0.136 g KH2PO4、4.0 g NaCl和0.1 g KCl，用超純水溶解并定容至500 mL。采用HCl或NaOH調至pH 1.0～12.0。

Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)

(1)

其中，Yu和Ys分別為待測物質和參比標準物質的熒光量子產率;Fu和Fs分別為待測物質和參比物質的積分熒光強度;Au和As分別為待測物質和參比物質在該激發波長的入射光的吸光度。

2.2.4 細胞毒性實驗取對數生長期的Hela細胞，稀釋成1.0×104cell/mL的細胞懸液，接種到96孔板中，每孔100L，孵育24 h。加入濃度為0、5、10、15、20、25和30mol/L的探針ISND溶液(DMEM高糖培養基為溶劑)，孵育24 h。利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應比色法測定490 nm處吸光度值，根據公式(2)計算細胞存活率(Viability,V)。

V(%)=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%

(2)

其中，As為實驗組吸光度值，Ac為對照組吸光度值，Ab為空白組吸光度值。

2.2.5 細胞熒光成像取對數生長期的Hela細胞，稀釋成2.0×104cell/mL的細胞懸液，接種到培養皿中，每孔2 mL，孵育24 h。待細胞貼壁后，移除培養基，PBS沖洗細胞3次。以DMEM培養基配制探針ISND溶液(10mol/L)， 37℃ 5% CO2孵箱中孵育30 min。用PBS沖洗去除多余的探針ISND，利用共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態及熒光成像。上述細胞體系中加入(摩爾比是8, 8 eq)，孵育1 h。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞成像。

3 結果與討論

3.1 探針的光譜性能

表1 探針ISBD、ISPD和ISND的結構式及光譜性質

Table 1 Optics property and chemical structure of the probe ISBD, ISPD and ISND

3.2 探針ISND對pH值的響應性能

首先進行了探針ISND對不同pH值PBS緩沖溶液(pH=1.0-12.0)的紫外-可見光吸收光譜及熒光光譜的滴定實驗。探針ISND的紫外-可見吸收光譜隨pH值變化曲線見電子版文后支持信息圖S14，探針在581 nm和475 nm處出現兩個吸收峰，最大吸收峰位于581 nm，并且吸收峰值隨pH值的增加而不斷升高，在475 nm處的吸收峰則隨pH值的增加而逐漸降低，并在505 nm處擁有等吸收點。當探針 ISND溶液的pH值逐漸升高時，溶液的顏色由橙黃色逐漸變為紫紅色。熒光光譜如圖1A所示，探針 ISND在565 nm處的熒光強度隨pH值的升高而不斷增強(pH 2.0～8.0)，與對應pH值呈良好線性關系(圖1B)。當pH<2.0或pH>8.0時其熒光強度趨于穩定。在365 nm紫外燈照射下，熒光則由橙色逐漸變為紫紅色。以上實驗結果表明，在pH 2.0～8.0范圍內，探針ISND對pH值具有良好響應，能夠實現pH值的精準檢測。

圖1 (A)不同pH值的PBS緩沖溶液中，1.0×10-5 mol/L探針ISND的熒光光譜的變化情況(狹縫: 5 nm/10 nm)，插圖為在365 nm紫外光照射下，不同pH值的探針溶液的熒光變化; (B)探針ISND在565 nm處熒光強度與pH值的線性關系。Fig.1 (A) Fluorescence spectra of 1.0×10-5 mol/L ISND probe in phosphate buffer solution (PBS) with various pH values (slits: 5 nm/10 nm). Inset is picture of corresponding solution under 365 nm ultraviolet light; (B) Linear relationship between fluorescence intensity of the probe ISND at 565 nm and pH value.

3.3 探針ISND對的檢測性能

圖2 加入前(a)后(b)，探針ISND(1.0×10-5 mol/L)熒光強度隨溶液pH值的變化，溶劑為PBS緩沖溶液，激發波長為282 nmFig.2 Fluorescence intensity of probe ISND(1.0×10-5 mol/L)versus pH value of PBS solution in the absence and presence of λex=282 nm

圖3 (A)探針ISND的熒光發射光譜隨的濃度變化情況(0～8 eq)(狹縫: 10 nm/10 nm, 溶劑: pH=7.4的PBS緩沖溶液)， 插圖為365 nm紫外光下的照片; (B)探針ISND溶液熒光強度比 (F/F0) 與濃度的校正曲線Fig.3 (A) Fluorescence spectra of probe ISND (1.0×10-5 mol/L) in the presence of different concentrations of (0-8 eq) in PBS solution, pH=7.4. Inset is optical picture under 365 nm UV light; (B) Linear relationship of fluorescence intensity ratio (F/F0) versus concentration of

圖4 不同離子存在下探針ISND熒光強度的變化Fig.4 Fluorescence response of probe ISND (1.0×10-5mol/L) in the presence of (8 eq) with other anions (80 eq)0. 1. F-; 2. Cl-; 3. Br-; 4. I-; 5. 6. 7. S2-; 8. SCN-; 9. ClO-; 10. 11. 12. OAc-; 13. 14. Cys; 15. Hcy; 16. GSH; 17. CN-. Concentration of ISND is 1.0×10-5 mol/L. Concentration of is 8.0×10-5 mol/L (8.0 eq). Concentration of each other substance is 8.0×10-4 mol/L (80 eq) respectively.

3.4 檢測機理

圖5 探針ISND對的檢測機理: a、b、c、d為反應物相應位置的核磁質子峰; a1、a2、b1、c1、d1為產物相應位置的核磁質子峰Fig.5 Proposed sensing mechanism of ISND for detection of a, b, c and d respectively represent the NMR proton peaks at the corresponding positions of the reactants. a1, a2, b1, c1 and d1 represent the NMR proton peaks at the corresponding positions of the products, respectively

3.5 實際樣品分析

圖6 MTT法測定Hela細胞與探針ISND共孵育24 h后的存活率, C為對照Fig.6 Viability of HeLa cell after incubated with probes ISND by MTT method, C represents control sample

3.6 探針ISND的細胞毒性實驗

采用MTT法檢測了探針的細胞毒性。如圖6所示，HeLa細胞與不同濃度的ISND(5～30mol/L)溶液孵育24 h后，仍然呈現良好的細胞形態，細胞存活率大于90%，表明探針ISND具有良好的生物相容性和低細胞毒性。

3.7 探針ISND的細胞成像實驗

圖7 (A) Hela細胞與探針ISND(1.0×10-5 mol/L)共孵育30 min后的熒光共聚焦顯微鏡圖像; (B) 再加入飽和當量(8 eq)共孵育1h后的熒光共聚焦顯微鏡圖像(激發波長405 nm)。左: 熒光圖像; 中: 明場圖像; 右: 重疊圖像Fig.7 Confocal fluorescence microscopy imags of (A) living Hela cells incubated with probe ISND (1.0×10-5 mol/L), and (B) further incubated with 8 eq λex=405 nm. Left: fluorescence image; middle: bright field image; right: merged image

4 結 論