HPLC法測定水溶性肥料植物生長調節劑的不確定度評定

段路路, 黃婧*, 王凱越

(1.上海化工院檢測有限公司, 上海 200062; 2.上?；ぱ芯吭河邢薰? 上海 200062)

植物生長調節劑是一類植物生長激素，在低濃度下即具有調節植物生長和發育的作用，通常由人工合成或者從生物中提取[1]。常用的植物生長調節劑有生長素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯和赤霉素等[2]。其中，脫落酸(abscisic acid, ABA)可影響植物性別分化、促進花芽分化或果實成熟等；氯吡脲(forchlorfenuron，FLFR)對植物生長的促進作用效果優異；萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)具有促進植物細胞分裂，誘導不定根形成等特點；烯效唑(uniconazole，S-3307)可抑制細胞伸長、使作物矮壯，通常作為果樹、花卉等的生長延緩劑。合理使用這些植物生長調節劑可以明顯提高作物的產量和品質，并能提高經濟效益和社會效益。據有關學者統計，在中國境內批準登記使用的植物生長調節劑品種有38個，共587個產品[3]。目前，我國植物生長調節劑的年產量接近2 000 t，常用品種近百個，植物生長調節劑的使用一直受到社會的普遍關注[4]。

我國作為農業大國，肥料對糧食增產增效具有不可替代的作用，因此肥料的合理使用在農業生產過程中起到了積極的增產作用。由于植物生長調節劑屬于農藥登記的范疇，很多水溶性肥料生產企業將脫落酸、氯吡脲、萘乙酸和烯效唑等植物生長調節劑添加到肥料中，給肥料產品質量安全帶來潛在風險。吳愛娟等[5]研究表明，違規或過量施的這4種植物生長調節劑，會在農作物植株中并通過食物鏈進入人體，被吸收后會不斷積累，導致人體支端肥大、骨質疏松、惡性腫瘤等疾病，且易使兒童提前發育、過早成熟等，嚴重者會導致人體免疫功能下降，甚至出現致畸、致癌、致基因突變等嚴重后果，并對生態環境造成嚴重影響。因此建立水溶性肥料中植物生長調節劑的檢測方法，迫在眉睫。

目前，水果、蔬菜中氯吡脲、萘乙酸、烯效唑、脫落酸等植物生長調節劑的殘留常用酶聯免疫法、萃取-光度法、液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液質聯用法[6-13]等檢測，其測試結果的質量需要用不確定度來表示。不確定度是與測量結果相關聯的參數，用于表征合理地賦予被測量值的分散性，測量水平越高，試驗質量越高，則測量不確定度越小，反之亦然。隨著科技的發展，為了更合理、科學地控制食量，不確定度被廣泛應用于環境監測、食藥品檢驗等領域中。為了表征檢測結果的準確性，通常采用不確定度[14-16]來對檢測結果進行說明，一般可以從人的因素(人)、儀器因素(機)、物料因素(料)、檢測方法因素(法)和環境因素(環)5個方面進行評定，即不確定度越小，表明測量結果越準確、越可信。目前國內外已有對肥料中植物生長調節劑檢測的報道，但對于水溶性肥料中植物生長調節劑檢測的不確定性評定，尚未見報道。基于高效液相色譜法具有定量準確、靈敏度高等特點，本研究擬參考化學分析中不確定度的評估指南[17]以及相關資料[18-19]，用前處理方式和HPLC條件對水溶性肥料中的氯吡脲、萘乙酸、烯效唑、脫落酸4種常見植物生長調節劑進行分析測定，從實驗室采用的試驗方法、標準物質、儀器設備、樣品前處理過程等因素進行不確定度評定[20-21]，對不確定度的來源從人、機、料、法、環方面進行來源分析，從而建立HPLC法測定水溶性肥料中植物生長調節劑含量的不確定度數學模型，以確保數據的準確性和可靠性。研究結果表明，本研究開發出的檢測方法是一個操作簡單、效率高的檢測系統，可為水溶性肥料行業的健康發展提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共選用4個水溶性肥料產品，分別編號為WSF1、WSF2、WSF3、WSF4。所用的4種標準物質為氯吡脲(純度99.6%，德國Dr.Ehrensforfer公司)、1-萘乙酸(純度96.9%，德國Dr.Ehrensforfer公司)、烯效唑(純度99.8%，德國Dr.Ehrensforfer公司)、脫落酸(純度98.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司)。試驗所用主要試劑為甲醇(色譜純)、甲酸(分析純)。

1.2 儀器與設備

LC-20 A高效液相色譜儀(日本島津公司)，帶二極管陣列檢測器(SPD-M 20 A),柱溫箱(CTO-20 A)和PDA數據處理器；ME204-2電子天平(梅特勒公司)；漩渦混合器；超聲波清洗器；高速離心機。

1.3 試驗方法

1.3.1標準溶液配制 分別準確稱取脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑4種標準品0.090 0～0.110 0 g，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，溶液濃度為1 mg·mL-1，然后配置濃度依次為2、10、25、50、100 mg·L-1的標準工作溶液，現配現用。

1.3.2樣品前處理 稱取0.100 0～1.000 0 g水溶性肥料樣品，置于10 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容后高速離心10 min，取1 mL上清液過0.22 μm有機相濾膜，待測。

1.3.3分析條件 色譜柱選用Shim-pack C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相及梯度洗脫條件見表1，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為258 nm(氯吡脲、烯效唑、脫落酸)或280 nm(萘乙酸)，進樣量為10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.4數學模型的建立 用以下公式對試樣中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑含量建立數學模型。

式中，W指試樣中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑的含量(mg·kg-1)；c0指試樣溶液中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的實測濃度(mg·L-1)；V指樣品定容體積(mL)；m指樣品稱樣質量(g)。

君不行仁政而富之，皆棄于孔子者也，況于為之強戰？爭地以戰，殺人盈野；爭城以戰，殺人盈城，此所謂率土地而食人肉，罪不容于死。故善戰者服上刑，連諸侯者次之，辟草萊、任土地者次之。[4](P283)

(1)

urel(c0)=u(c0)/c0

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

U=2uc(w)

(9)

1.4 識別與分析測定過程的不確定度來源

根據測量步驟以及上述數學模型的計算公式分析，可得HPLC法測定水溶性肥料中植物生長調節劑含量的不確定度初步因果圖(圖1)。根據《化學分析中不確定度的評估指南》[12]中的規定，使用最小二乘法擬合c0的前提是,假設橫坐標的不確定度遠小于縱坐標的不確定度，即用于定量的工作曲線溶液濃度的不確定度足夠小，以致于可以忽略不計。

圖1 植物生長調節劑測定的不確定度來源因果圖

2 結果與分析

2.1 最小二乘法擬合標準溶液濃度引入的不確定度

為校準高效液相色譜儀，采用準確稱量脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的標準物質配制成2、10、25、50、100 mg·L-15種濃度的標準工作溶液，每種標準工作溶液用高效液相色譜儀測定3次，可以得到相應的峰面積A，用最小二乘法擬合，得到每種標準工作溶液的直線回歸方程A=a+b×c(a為線性方程的截距，b為線性方程的斜率)和R2(表2)。R2值均大于0.999，表明4種生長調節劑標準工作溶液的濃度與高效液相色譜儀測定的響應值顯著正相關，用此方法測量的精密度較高。

表2 4種植物生長調節劑最小二乘法擬合的線性關系

由濃度—峰面積最小二乘法擬合求得試樣溶液的濃度(c0)，則c0的標準不確定度[u(c0)]和相對不確定度[urel(c0)]參照1.3.5中公式(1)和(2)計算，因為每種植物生長調節劑測試3次，檢測了4種植物生長調節劑，因此式中n=3×4=12；測定次數(p)為1。4個樣品的u(c0)和urel(c0)計算結果見表3。

表3 標準工作溶液最小二乘法擬合引入的不確定度

2.2 試樣稱樣引入的不確定度

表4 樣品稱量引入的不確定度

2.3 試樣溶液定容引入的不確定度

2.4 試驗過程隨機效應引入的不確定度

表5 測量過程隨機效應引入的不確定度

2.5 合成不確定度和擴展不確定度的計算

根據以上研究，水溶性肥料樣品中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑含量測定產生的不確定度包括標準工作曲線線性擬合引入的不確定度、樣品稱重產生的不確定度以及樣品重復性測定引入的不確定度。因此，采用HPLC法測定水溶性肥料中4種植物生長調節劑的相對合成不確定度[ucrel(w)]和合成不確定度[uc(w)]，參照1.3.5中公式(7)和(8)。

在95%置信度水平下，取擴展因子(k)為2，則HPLC法測定植物生長調節劑的擴展不確定度為：U=2×uc(w)，按照此公式計算4個樣品中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的不確定度，結果(表6)可知，相對合成不確定度的來源主要是樣品濃度測定中標準曲線的擬合引入的不確定度和樣品重復測定引入的不確定度。

表6 樣品中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的不確定度

圖2 4種生長調節劑擴展不確定度與含量的線性擬合

3 討論

不確定度是用于說明測量分散性的參數，由分析和評定得到，科學的評估方法是關鍵。不確定度評定是提高檢測質量要求的主要內容，不確定度越小，表明測量結果越準確可信。不確定度評定主要包括以下幾個步驟：①規定被測量不確定度；②識別不確定度的來源；③不確定度分量確定并計算；④計算合成不確定度；⑤報告不確定度。本研究建立了HPLC法測定水溶性肥料中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑含量的測試系統，并對測定過程中不確定度來源的各個分量進行分析。研究發現，建立的HPLC檢測方法測定水溶性肥料中不同植物生長調節劑的不確定度數學模型，是一個操作簡單且效率高的檢測系統。

本研究發現，影響HPLC法測定水溶性肥料中植物生長調節劑含量的測量不確定度主要有兩個來源，一是定量測定中使用標準物質配置成標準工作曲線的線性擬合引入的不確定度，二是樣品測試過程中引入的隨機效應即重復測定，而使用的不同標準物質的純度、樣品的稱量、樣品前處理等引入的不確定度對最終的合成不確定度影響不大。郭霞等[23]用HPLC法測定了復混肥料中縮二脲含量的不確定度，得出影響結果的主要不確定度分量為擬合校準曲線引入的不確定度；郝霞莉等[24]用高效液相色譜法檢測了脫毛類化妝品中巰基乙酸含量的不確定度，認為主要不確定度來源于標準曲線擬合、標準溶液配制以及試樣測量重復性；肖利龍等[25]通過HPLC法研究了花生醬中黃曲毒素B1結果的不確定度評定，認為影響檢測結果的6個不確定度分量中，樣品前處理過程和標準工作液配制引入的不確定度對結果影響較大；牛日華[26]采用液相色譜法對水產品中恩諾沙星殘留量進行檢測，發現測定結果的不確定度主要來源于樣品前處理和標準溶液；李煜婷等[27]用固相萃取-高效液相色譜法測定了土壤中苯并(a)芘的不確定度，研究表明，標準曲線擬合和標準溶液配置產生的不確定度對合成不確定度的影響較大，而樣品稱量所引入的不確定度較小，可忽略不計；劉文星[28]研究了液相色譜法測定戊醛中催化劑不確定度的評定，其中標準物質的純度、標準樣品和樣品測量重復性對測量不確定度的影響較大?？梢娚鲜鲅芯颗c本研究類似，均表明用HPLC法測定食品、化工品、土壤、肥料等不同基體中的特定物質含量的不確定度評定中，主要不確定度來源為標準溶液配制和線性擬合；此外，由于研究對象基體不同，樣品測定重復性對不確定度的貢獻也較大。因此，建議在分析過程中，實驗人員應首先評估實驗過程中引起不確定度的各個分量的貢獻，排除不重要的分量，同時熟練掌握操作步驟，提高標準工作曲線的準確性和可靠性，增加平行測定次數，從而保證實驗結果的可靠性和準確性。本研究為水溶性肥料中其它植物生長調節劑含量測定的不確定度評定提供理論參考和依據。