歐洲纈草不定根誘導與懸浮培養的研究

李文杰, 李美陽, 宮惠

(延邊大學農學院, 吉林 延吉 133002)

歐洲纈草(ValerianaofficinalisL.)屬于敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(Valeriana)多年生草本植物。以根及根莖入藥[1]，具有鎮靜安神、解痙止痛之功效，多用于治療神經衰弱、失眠、癲癇等[2]，主要藥用活性成分是纈草三酯和纈草烯酸[3]。近年來，人們生活節奏加快，生活壓力增大，失眠、抑郁、腫瘤等疾病越來越多，而纈草正是一種天然鎮靜、解痛劑[4]，所以人們對纈草提取物及其制劑的需求日益增加。

問：“這些日子你丈夫沒給你打電話？”劉珊珊冷冷地說：“沒打，我們雖然是夫妻，卻形同陌路，他已經出差半年多了，也不知道去了哪里！”江帆懷疑劉珊珊在騙他，吼道：“我老婆被你老公拐跑了，我今天是來找他算賬的。找不到他，我就……”說著，又亮出了匕首！劉珊珊被嚇出了眼淚，一臉無辜地哀求：“大哥，我真不知道。我根本管不了他！我連他手機都打不通。”江帆怒不可遏：“我快被你老公搞瘋了，再找不到李輝，我就殺了你，看他回不回來……”江帆越說越激動，手中的匕首亂晃！

纈草屬植物主要分布于氣候溫和潮濕的地區，遍布整個歐洲、亞洲北部、南美洲以及美國[5]。自然生長十分緩慢，需求增多導致野生纈草資源急劇下降。建立人工種植生產基地，對緩解和保護野生資源意義重大。但在長期人工栽培過程中，品種退化、混雜現象嚴重，優質高產的遺傳穩定性難以保持，大大影響了藥材的質量和產量[6]。所以，采用植物組織培養技術顯得十分迫切。

“三農”工作是我國經濟工作的重要組成部分，長期以來一直是黨的工作的重中之重。在決勝全面建成小康社會的背景下，如何滿足農民追求美好生活需求，實施鄉村振興戰略是今后解決“三農”問題，全面激活農村發展新活力的重大行動。進一步建立健全城鄉融合發展的體制機制和政策體系，加快推進農業農村現代化，才能使農村的“三農”活力被真正激發起來。堅持農業農村優先發展，鞏固和完善農村基本經營制度，深化農村集體產權制度改革，保持土地承包關系穩定并長久不變，把中國人的飯碗牢牢端在自己手中，構建現代農業產業體系，促進農村一二三產業融合發展，這些都是推進“三農”建設的根本。

國內外研究表明，許多物種的不定根培養具有穩定合成次生代謝物質的能力[6]，并且已在何首烏等藥用植物中得以成功應用[7]，而歐洲纈草正是以根和根莖入藥，所以將組織培養技術與歐洲纈草不定根大量繁殖相結合可以快速有效地解決纈草提取物及其制劑供應不足的問題。雖然國內外學者先后開展了纈草的組織培養研究，但大多都是愈傷組織誘導和組培快繁類研究[8]，而對纈草不定根誘導方面的研究多為外植體或者外源激素單一因素，對纈草不定根懸浮培養方面的研究很少。本研究以歐洲纈草無菌苗的葉片和莖段為外植體，研究了不同濃度吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)、吲哚丁酸(3-indolebutyric acid，IBA)對不定根誘導的影響，將外植體類型和外源激素兩種誘導因素相結合，再以誘導的不定根為材料，考察了不同培養基種類、不同外源激素對不定根懸浮培養的影響,旨在篩選歐洲纈草不定根誘導及懸浮培養的理想條件和培養基，利于歐洲纈草不定根的高效生產，為歐洲纈草提取物及其制劑的工業化生產提供參考。

取一定數量的種子在流動水下沖洗30 min，然后在超凈工作臺中用75%的酒精溶液浸泡消毒30 s，再用4%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，浸泡的過程中應不斷攪拌，使其能夠消毒完全，然后再用無菌水沖洗3～5次后放到無菌濾紙上吸干種子表面水分后，將種子接種到MS固體培養基上，每瓶20粒種子，共30瓶。培養溫度為(25±2)℃，光照強度1 200 lx,光照時間12 h。每天注意記錄和觀察種子發芽時間和發芽率。待無菌苗生長30 d時，從中選取較寬大的葉片(約為2.5 cm×1.0 cm)，切成0.5 cm×0.5 cm大小的葉片作為外植體，再選取粗度均勻的莖(直徑約為1.5 mm)，切成1 cm左右不含節間的莖段作為外植體，用于下一步不定根誘導試驗。

首先，很多學校由于師資力量的匱乏，導致沒有專門的道德與法治教師，這門課程多是由其他科目的教師兼任。但是教師由于缺乏專業的法律常識，只能是依照教材內容進行講授，不能夠深入分析相關案例并普及相關法律知識，導致學生的法治觀念薄弱，不利于其綜合發展。其次，很多學校的教材內容過于陳舊，案例不夠典型，很難真正起到提高學生道德與法治意識的作用，導致學生的成長受阻。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2.1.2不同濃度IAA對不定根誘導的影響 不同濃度IAA對不定根的誘導效果見表2和圖1。當以莖段為外植體時，隨IAA濃度的增加不定根生根率先降低后稍稍增加之后又大幅度降低，當IAA濃度為0.05 mg·L-1時，生根率最高，達80.56%，并且生根數較多，生長旺盛、不定根粗長；以葉為外植體時，隨IAA濃度的增加不定根生根率先增加后降低，當IAA濃度為1.0 mg·L-1時，不定根生根率最高，達85.19%，同時不定根生長旺盛、生根數最多但較細短。從表2可知，外植體為莖段時，生根率、生根外植體數和總根數最高的都是IAA濃度0.05 mg·L-1；外植體為葉片時，生根率、生根外植體數和總根數最高的都是IAA濃度1.0 mg·L-1，并且兩者與其他濃度存在顯著差異(P<0.05)。但從圖1看，莖段為外植體IAA濃度為0.05 mg·L-1的不定根粗長明顯優于葉片為外植體IAA濃度為1.0 mg·L-1。綜合來看，MS+0.05 mg·L-1IAA是誘導不定根的理想培養基。

1.2 歐洲纈草無菌苗的獲得

且夫兩漢而下，文之不如古者，豈其所謂繩墨轉折之精之不盡如哉？秦漢以前，儒家者有儒家本色，至如老莊家有老莊本色，縱橫家有縱橫本色，名家、墨家、陰陽家皆有本色。雖其為術也駁，而莫不皆有一段千古不可磨滅之見，是以老家必不肯剿儒家之說，縱橫必不肯借墨家之談，各自其本色而鳴之為言。其所言者，其本色也。是以精光注焉，而其言遂不泯于世。［13］294-295

1.3 歐洲纈草不定根的誘導

1.4.1不同培養基對歐洲纈草不定根懸浮培養的影響 試驗所涉及6種培養基(MS、RCM、B5、WPM、SH、White)均為原配方組分，添加30 g·L-1蔗糖，并根據試驗需要添加不同種類和濃度的外源激素，pH 5.7，分裝后121 ℃下滅菌15 min。選取0.5 mg·L-1NAA濃度下誘導的、粗細均勻的不定根，將其從根尖部位切取1 cm，接種到含有上述6種培養基的50 mL三角瓶中，每瓶接種10個根尖部位，每種培養基10瓶重復。

生根率=生根外植體數/接種外植體數×100%。

1.4 歐洲纈草不定根的懸浮培養

以MS為基本培養基，添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂8.0 g·L-1，配制成含NAA、IAA或者IBA(3種激素濃度梯度均為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg·L-1)的固體培養基。再將外植體莖段和葉片分別接種到已配制好的培養基中。每種激素濃度下的莖和葉均做10瓶重復，培養溫度為(25±2)℃，暗培養。注意觀察統計生根外植體數、生根總數以及根形態(肉眼對比觀察界定粗細和長短)，計算生根率。

接種前稱量培養基總重量，接種時要注意用無菌水將根尖的固體培養基清洗干凈，接種后稱量培養基總重量，得到接種量。

表2為不同活化條件下酵母菌發酵特性標準化處理值之和（即OI總值），大多高于普通活化所得OI總值（5.82），表明發酵前適應活化處理可提高釀酒酵母菌的發酵特性。

接種量(g)=接種后培養基總重量(g)-接種前培養基總重量(g)。

采用Excel軟件整理數據，采用SPSS17.0軟件對數據進行統計學分析。

干物率=收獲干重/收獲鮮重×100%；

1.4.2不同外源激素對歐洲纈草不定根懸浮培養的影響 以RCM為基本培養基，添加蔗糖30 g·L-1，制作含有NAA(濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1)和IAA(濃度分別為0.05 mg·L-1、0.5 mg·L-1)的培養液，選取0.5 mg·L-1NAA下誘導的、粗細均勻的不定根，將其接種到上述培養液中，每種激素濃度10瓶重復。接種注意事項、培養條件及稱量方法等同1.4.1節。

1.5 數據統計分析

接種后移至搖床培養，轉速為120 r·min-1，培養溫度為(25±2)℃，暗培養，30 d后收獲。用無菌水將不定根上殘留的培養液沖洗干凈，用濾紙吸干水分，于分析天平稱量，得到收獲鮮重(收獲量)。在40 ℃干燥箱中干燥至恒重，于分析天平稱量，得到收獲干重。

人，無論生于哪個時代，處于何方地界，都要不同程度的面對人“生”的煩惱和對人“死”的恐懼，從這種精神境界上講，超脫生死便成了人的終極目標，所以才有了對宗教的信仰和研究。對佛教而言，成佛是學佛的真正目的，既然佛性人本具足，為什么人仍處于“人”的狀態，而未成佛？為了解釋這一點，首先要了解一下對佛性的不同稱謂。隨著佛教的發展，“佛性”一詞有了更多的異名，如：中道、涅槃、法性、真如、實際、法界、如來藏……等等。這些不同的稱謂，在不同的語境中所表達的意義并不完全一樣，但都和佛性基本相同或相通。“如來藏”與“佛性”相通，佛教用如來藏理論來說明人未成佛之因。

2 結果與分析

2.1 外源激素對不定根誘導的影響

2.1.1不同濃度NAA對不定根誘導的影響 不同濃度NAA對不定根的誘導效果見表1和圖1。當以莖段為外植體時，隨NAA濃度的增加不定根生根率先增加后降低，當NAA濃度為0.5 mg·L-1時，生根率最高，達94.44%，生根數最多、生長旺盛且不定根粗長；以葉為外植體時，隨NAA濃度的增加不定根生根率呈現增長趨勢，當NAA濃度為2.0 mg·L-1時，不定根生根率最高，達88.89%，不定根生長旺盛、生根數最多但不定根較細短。從表1可知，生根率、生根外植體數和總根數最高的都是NAA濃度0.5 mg·L-1，并與其他濃度存在顯著差異(P<0.05)，說明MS+0.5 mg·L-1NAA是誘導不定根的理想培養基。

表1 NAA濃度和外植體類型對歐洲纈草不定根誘導的影響Table 1 Effects of NAA concentration and explant types on adventitious root induction of V. officinalis

A: 0.5 mg·L-1 NAA下莖段誘導的不定根; B: MS+0.05 mg·L-1 IAA下莖段誘導的不定根; C: MS+0.05 mg·L-1 IBA下莖段誘導的不定根; D: MS+2.0 mg·L-1 NAA下葉片誘導的不定根; E: MS+1.0 mg·L-1 IAA下葉片誘導的不定根; F: MS+0.1 mg·L-1 IBA下葉片誘導的不定根。A: Induced adventitious roots by stem segments under MS+0.5 mg·L-1 NAA; B: Induced adventitious roots by stem segments under MS+0.05 mg·L-1 IAA; C: Induced adventitious roots by stem segments under MS+0.05 mg·L-1 IBA; D: Induced adventitious roots by leaf under MS+2.0 mg·L-1 NAA; E: Induced adventitious roots by leaf under MS+1.0 mg·L-1 IAA; F: Induced adventitious roots by leaf under MS+0.1 mg·L-1 IBA.圖1 不同誘導條件下的歐洲纈草不定根Fig.1 Adventitious roots of V. officinalis under different induction conditions

歐洲纈草種子采自延邊大學農學院3號溫室內的三年生實生苗植株。歐洲纈草種子采下晾干后，置于4 ℃冰箱冷藏待用。

2.1.3不同濃度IBA對不定根誘導的影響 不同濃度IBA對不定根的誘導效果見表3和圖1。當以莖段為外植體時，隨IBA濃度的增加不定根生根率呈逐漸降低的趨勢。當IBA濃度為0.05 mg·L-1時，生根率最高，達83.33%，并且生根數多，生長旺盛、不定根粗長，與其他濃度有顯著差異(P<0.05)，說明當莖段為外植體時MS+0.05 mg·L-1IBA是誘導不定根的理想培養基；以葉為外植體時，隨IBA濃度的增加不定根生根率先增加后降低，當IAA濃度為0.1 mg·L-1時，不定根生根率最高，達85.19%，同時不定根生根數較多，生長較旺盛、不定根也較粗長。從表3來看，葉片為外植體、IBA濃度為0.1 mg·L-1的生根率要稍優于莖段為外植體、IBA濃度為0.05 mg·L-1，但是前者不定根總數較少，并且兩者與其他濃度存在顯著差異(P<0.05)。另外，從圖1也可以看出，后者的不定根不但總數比前者多而且不定根也比前者粗長。所以，MS+0.05 mg·L-1IBA是誘導不定根的理想培養基。

表2 IAA濃度和外植體類型對歐洲纈草不定根誘導的影響Table 2 Effects of IAA concentration and explant types on adventitious root induction of V. officinalis

表3 IBA濃度和外植體類型對歐洲纈草不定根誘導的影響Table 3 Effects of IBA concentration and explant types on adventitious root induction of V. officinalis

2.1.4不定根誘導理想條件 將圖1中C和D、E和F、G和H進行兩兩比較，可以看出,以莖為外植體誘導的不定根數目多且粗長，明顯優于以葉片為外植體。所以，莖段是不定根誘導的理想外植體。雖然在以莖為外植體時，0.5 mg·L-1NAA、0.05 mg·L-1IAA以及0.05 mg·L-1IBA誘導的不定根都生長旺盛、粗長，但是從誘導不定根的數量上看0.5 mg·L-1NAA>0.05 mg·L-1IBA>0.05 mg·L-1IAA，另外，在整體誘導不定根的效果上NAA>IAA>IBA。因此，歐洲纈草不定根誘導的理想外植體為莖，理想培養基為MS+0.5 mg·L-1NAA。

藤尾死亡的結局也給讀者帶來巨大的震撼，夏目漱石給送去死的世界。雖然有很多讀者對藤尾的死唏噓不已，但藤尾的死是不可避免的。本書的名字是《虞美人草》，虞美人草原本就是在虞姬去世后埋葬的草，象征著虞姬和西楚霸王項羽美麗悲傷的愛情，藤尾和小野無法結出愛情的果實，間接暗示藤尾的死。文中沒有明確地描繪虞美人和項羽的故事，但是藤尾和小野交流的作品，死亡是藤尾最終的歸宿。

2.2 不定根懸浮培養

2.2.1不同培養基種類對不定根懸浮培養的影響 從表4可以看出，6種培養基中，RCM培養基表現最好，不定根生長旺盛，數目多且較粗長(圖2)，其收獲鮮重達7.80 g·L-1，收獲干重達1.46 g·L-1，并且其干物率也最高，為18.73%，其次是MS培養基，最差的是White培養基(圖2)，不定根幾乎不生長，不同種類培養基間收獲鮮重、收獲干重和增殖倍數存在極顯著差異(P<0.01)，不同種類培養基間干物率不存在顯著差異。雖然接種量有些差異會影響增殖情況，但是從增殖倍數和圖2綜合來看，RCM培養基是歐洲纈草不定根懸浮培養的理想培養基。

2.2.2不同外源激素對不定根懸浮培養的影響

從表5可以看出，不定根的增殖倍數隨著NAA濃度的增加先增加后降低，與之前不定根誘導時表現相同，即在NAA濃度為0.5 mg·L-1時，增殖倍數達到24.51倍，不定根生長旺盛(圖3)。不定根增殖倍數隨著IAA濃度的增加而降低，在IAA濃度為0.05 mg·L-1時，增殖倍數達到18.02倍，不定根生長較旺盛(圖3)，不同激素濃度間纈草不定根的增殖情況有極顯著差異(P<0.01)。雖然接種量有些差異會影響增殖情況，但是從不定根生長和增殖倍數(圖3)綜合來看，0.5 mg·L-1NAA是歐洲纈草不定根懸浮培養的理想外源激素。

表4 培養基種類對不定根懸浮培養的影響Table 4 Effects of medium types on the suspended culture of adventitious roots

表5 外源激素對不定根懸浮培養的影響Table 5 Effect of exogenous hormones on the suspended culture of adventitious roots

圖3 不同外源激素下懸浮培養的不定根Fig.3 Adventitious roots of suspended culture by the different exogenous hormones

3 討論

3.1 不定根誘導理想條件

近年來,研究證實植物次生代謝產物在已分化的器官中比愈傷組織、懸浮細胞中含量高，研究重點也逐漸轉移到了已分化的不定根等器官的培養上[9]。通過使外植體在培養過程中分化而產生的不定根，其結構和代謝特征具有合成次生代謝產物能力強、基因型穩定和代謝產物穩定等優點[10-11]，同時韓國高麗參不定根大規模培養[12]、雷公藤不定根中試放大[13]、紫松果菊不定根規模化生產[14]、丹參不定根的中試[15]、甘草不定根反應器培養[16]等研究充分說明藥用植物不定根培養是根部活性成分含量較高植物工業化生產的有效途徑。

不定根的發生受許多因素的影響，其中生長素類物質和外植體類型對不定根的發生起著關鍵作用，生長素類似物會影響不定根的細胞分化，發育以及形態的建成，而不同外植體對不定根的誘導能力不同。不同藥用植物適宜誘導的外植體不同，適宜誘導不定根的激素種類和濃度不同[17]，Wu等[18]在考察了IAA、IBA、NAA等不同生長素對紫錐菊不定根的誘導情況后，發現IBA是誘導的最佳激素；袁媛等[19]在蒼術不定根培養中分別考察了根、葉片、葉柄、子葉4種材料對不定根誘導的影響，發現以葉片為外植體時不定根誘導率最高，根次之；張堅等[20]在對甘草不定根研究中發現，NAA較IBA更有利于不定根的誘導，BA和KT則抑制不定根的誘導；外植體為根時誘導率為100%，而外植體為莖時不能誘導出不定根，形成了愈傷組織。本試驗研究了纈草莖和葉片兩種外植體在不同濃度IAA、NAA和IBA下不定根誘導情況，結果發現莖段為外植體要優于葉片，NAA要優于IBA、IAA，MS+0.5 mg·L-1NAA是誘導不定根的理想培養基。

3.2 不定根懸浮培養理想條件

不定根的懸浮培養同樣受許多因素的影響，其中,培養基種類和外源激素對不定根的增殖發生起著關鍵性的作用。

不同的基本培養基中含有不同濃度的無機鹽、碳源、維生素等物質，可造成培養效果不同。李斌等[21]發現MS為金鐵鎖不定根生長的較優基本培養基；楊秀蓮等[22]研究發現MS培養基更適合海州常山葉片愈傷組織的形成。本試驗在研究不同培養基種類對不定根懸浮培養的影響時發現，RCM培養基特別適合歐洲纈草不定根的懸浮培養，增殖倍數達7.64±1.94，生長勢好，顯著優于其他培養基；在以RCM為基本培養基，研究不同濃度NAA和IAA對歐洲纈草不定根懸浮培養的影響時，發現NAA和IAA對歐洲纈草不定根增殖均起到良好的作用，但NAA對不定根增殖效果優于IAA，并且NAA濃度為0.5 mg·L-1時不定根增殖效果最好，增殖倍數達24.51±3.94，在生物量和生長速度上顯著優于崔磊[23]的研究結果(以MS+ 0.2 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1KT懸浮培養寬葉纈草不定根，接種28 d后生物量為623 mg，生長速率為420%)。本研究所得方法更有利于短期內獲得大量不定根。可能是因為RCM培養基中某種離子或者大分子可以促進歐洲纈草不定根細胞伸長和分裂，從而使得不定根長度和數量的顯著增加。歐洲纈草不定根有效成分種類和含量的分析測定以及外源激素對歐洲纈草不定根誘導機制等問題，還需進一步的研究。