表達Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的轉基因玉米GAB-3對四種主要鱗翅目害蟲的抗性評價

徐曉麗,姜媛媛,王鵬飛,來勇敏,陳笑蕓,徐俊鋒*

(1.浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所, 杭州 310021;2.浙江大學農業與生物技術學院, 杭州 310012)

玉米是全球主要種植作物之一，也是我國重要的糧食作物和飼料作物，對穩定農業產業結構和食品安全有重要作用。在我國，玉米在生育期極易受黏蟲Mythimnaseparata(Walker)、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等鱗翅目害蟲的為害，嚴重時會導致減產甚至絕收[1-2]。亞洲玉米螟屬于鱗翅目草螟科，是我國玉米生產上為害較嚴重的害蟲，幼蟲為害玉米未展開的幼嫩心葉，大齡幼蟲蛀莖，阻斷營養運輸，還直接蛀食玉米雌穗，造成霉變，嚴重影響玉米產量和品質[3-4]。黏蟲和棉鈴蟲屬于鱗翅目夜蛾科，黏蟲取食玉米葉片，形成缺刻，嚴重時可造成絕收，近幾年黏蟲在局部爆發成災，嚴重發生的局面常有發生；黃淮海地區由于棉花種植面積降低，棉鈴蟲對玉米為害加重[5]。除上述幾種常見害蟲外，2019年草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J. E. Smith)成為威脅我國玉米產業的又一重要害蟲。草地貪夜蛾源于美洲熱帶和亞熱帶地區，屬鱗翅目夜蛾科，是世界范圍內嚴重威脅糧食安全的重大災害生物，2019年侵入我國，并快速擴散[6]，對我國農業生產造成嚴重危害[7]。

長期以來，化學農藥是防治害蟲的主要方法，不僅污染生態環境，同時易殺傷非靶標生物，不利于有害生物的綜合治理[8]，由于長期單一用藥產生的抗藥性導致化學防治效果不斷降低。轉基因抗蟲玉米的商業化種植為防治害蟲提供了新途徑，并逐漸成為一些國家防控害蟲的主要的手段。殺蟲晶體(insecticidal crystal，Cry)蛋白是應用廣泛的殺蟲蛋白，其中在玉米上應用的抗鱗翅目害蟲的Cry蛋白主要包括Cry1和Cry2，Cry1包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F、Cry1A.105等，Cry2主要是Cry2Ab[9]。轉基因抗蟲玉米的種植大大減少了化學農藥的使用，提高了玉米產量，但是20多年來持續地種植轉基因抗蟲植物也導致一些國家和地區抗性害蟲的出現[10-12]，為延緩害蟲抗性的產生，目前采取的策略是高劑量和庇護所，以及同時表達2種以上不同類型的殺蟲蛋白，前者是通過采用提高殺蟲蛋白的表達水平以及按比例在轉基因作物周圍種植非轉基因作物，使敏感個體和抗性個體交配，達到稀釋抗性基因的目的；后者通過雜交或多基因同時轉化在轉基因植物中同時表達2個及以上不同類型的殺蟲基因，既擴大了殺蟲譜，又能延緩害蟲抗性的產生[13-14]。

目前，我國已研發獲得多個轉基因玉米新品系進入不同階段試驗[15]。轉cry1Ab和cry2Ab基因抗蟲玉米GAB-3是浙江大學研發的轉基因抗蟲玉米新品系[16]。Cry1Ab和Cry2Ab蛋白在昆蟲中腸上的作用位點不同，有研究發現Cry1Ab和Cry2Ab在草地貪夜蛾中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上的結合位點不同，并且二者在控制害蟲上具有協同作用[17]，因此，同時表達這兩種殺蟲蛋白能夠起到擴大殺蟲譜和延緩害蟲抗性發生的作用。本研究旨在通過田間接蟲和室內生測的方法，研究評價轉基因玉米GAB-3對玉米生產上4種主要的鱗翅目害蟲的抗性。

1 材料與方法

1.1 供試玉米材料

轉基因玉米GAB-3表達Cry1Ab和Cry2Ab抗蟲蛋白，同時以G10evo-EPSPS基因作為篩選標記，供試用的轉基因玉米材料及其非轉基因親本對照種子瑞豐1號均由浙江大學沈志成提供，田間抗蟲性測試中除了非轉基因親本對照，還增加了浙江當地對照玉米品種浚單58，種子購自市場。

1.2 供試蟲源及培養條件

供試黏蟲、亞洲玉米螟、棉鈴蟲和草地貪夜蛾蟲卵購自北京延美生物科技有限公司，在人工氣候培養箱(BIC-250，上海博迅)孵化，溫度(27±1)℃，濕度(90%±5%)，光周期16 h光照/8 h黑。

1.3 玉米組織Cry1Ab和Cry2Ab蛋白表達量測定

采用ELISA方法檢測轉基因玉米各組織中殺蟲蛋白含量。在玉米心葉期(V7～V8)取植株幼嫩心葉，抽雄期取未散粉雄穗，吐絲期取花絲、苞葉、穗尖、穗軸，灌漿期取幼嫩籽粒，每種組織設10個生物學重復，每個生物學重復設3次技術重復。取30 mg不同玉米組織加入1 mL提取液，迅速研磨成漿，靜置2 h，離心后取上清。采用Cry1Ab/Cry1Ac和Cry2A檢測試劑盒(美國ENVIROLOGIX公司)檢測并繪制標準曲線。采用680酶標儀(美國伯樂)450 nm下測定吸光值。

1.4 室內抗蟲性測定

對黏蟲的抗性測定選取V6～V7期玉米相同部位葉片；對亞洲玉米螟和棉鈴蟲的抗性測定分別選取V7～V8期玉米幼嫩心葉、抽雄期尚未抽出的雄穗、吐絲期玉米的幼嫩花絲、苞葉、穗尖、穗軸及灌漿期玉米幼嫩籽粒；對草地貪夜蛾的抗性測定選取V6～V8期玉米相同部位葉片。黏蟲和亞洲玉米螟的生測以20頭初孵幼蟲為1個處理，設5次重復；為防止試蟲密度大導致自殘，棉鈴蟲和草地貪夜蛾采用5頭初孵幼蟲為1個處理，設20次重復。培養皿用封口膜封閉防止幼蟲鉆出，然后放置于培養箱中培養。每天固定時間檢查幼蟲存活情況并記錄活蟲數，同時更換相同來源的玉米組織，毛筆輕觸幼蟲不能爬行則視為死亡。當轉基因玉米組幼蟲存活率為0時，試驗結束。草地貪夜蛾生長至2齡后時容易出現自殘現象，測試時間為4 d。

1.5 田間抗蟲性測定

隨機區組設計，每品種設三次重復，小區面積為30 m2(5 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，并在試驗小區設置隔離帶。常規播種方式和栽培管理，全生育期不噴灑殺蟲劑。

1.5.1心葉期黏蟲抗蟲性評價 玉米心葉期(V6～V7)，用毛筆將黏蟲初孵幼蟲輕刷到玉米心葉，每小區接蟲40株，每株玉米接蟲40～60頭。接蟲14 d后逐株調查玉米葉片被害程度，分級標準及抗性評價標準參照農業部 953 號公告[18]。

1.5.2心葉期亞洲玉米螟抗蟲性評價 玉米心葉期(V7～V8)，用毛筆將亞洲玉米螟初孵幼蟲輕刷到玉米心葉，每小區接蟲40株，每株玉米心葉接蟲40～60頭。接蟲14 d后逐株調查玉米植株中上部位被亞洲玉米螟為害情況，分級標準及抗性評價標準參照玉米抗玉米螟鑒定技術規范[19]。

1.5.3吐絲期亞洲玉米螟抗蟲性評價 玉米吐絲期(全田60%以上的植株雌穗花絲露出苞葉)，用毛筆將亞洲玉米螟初孵幼蟲輕刷到花絲，每小區接蟲40株，每株玉米花絲接蟲40～60頭，接蟲14 d后調查玉米雌穗被害情況(包括花絲和穗尖被害情況、存活幼蟲數量和齡期及蛀孔隧道長度)，同時剖稈調查莖稈受害情況。雌穗被害級別分級標準及抗性評價標準參考農業部 953 號公告[18]。

1.6 數據處理

采用SPSS 20.0系統對所有數據進行方差分析，采用Duncan新復極差法對玉米組織ELISA檢測結果和田間抗蟲性數據進行多重比較分析，室內抗蟲性數據進行單因素方差分析，百分數進行反正弦轉換，采用LSD進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 GAB-3不同組織Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量

GAB-3不同組織中Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量見表1。ELISA檢測結果顯示，GAB-3不同組織中Cry1Ab含量為2.70～28.49 μg·g-1，心葉期葉片中Cry1Ab含量最高，達28.49 μg·g-1，接下來依次是灌漿期籽粒、雄穗、穗尖、穗軸、苞葉和花絲，不同組織Cry1Ab蛋白含量有顯著性差異(ANOVA:F=197.928;df=6;P<0.05)；GAB-3

表1 轉基因玉米GAB-3不同發育階段各組織中Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量Table 1 Content of Cry1Ab and Cry2Ab in transgenic maize GAB-3 tissues at different growth stages (μg·g-1 FW)

不同組織Cry2Ab含量為0.98～9.26 μg·g-1，雄穗中Cry2Ab含量最高為9.26 μg·g-1，接下來依次是穗尖、心葉期葉片、苞葉、穗軸、灌漿期籽粒和花絲，不同組織Cry2Ab含量有顯著性差異(ANOVA:F=139.962;df=6;P<0.05)。

2.2 GAB-3對4種鱗翅目害蟲的室內殺蟲效果

GAB-3不同生育期不同組織對4種鱗翅目害蟲的生測結果如表2所示。

表2 4種害蟲初孵幼蟲取食GAB-3和其非轉基因對照各組織后的存活率Table 2 Survival of neonate larvae of of feeding on different tissues of GAB-3 and its control

GAB-3心葉對黏蟲有很強的抗性，初孵幼蟲取食GAB-3葉片4 d后存活率為0，而非轉基因對照組黏蟲存活率為100%。

GAB-3心葉、雄穗、花絲、苞葉、穗尖、穗軸和籽粒等組織對亞洲玉米螟有很強的毒殺作用，各組織處理組的亞洲玉米螟初孵幼蟲在測試2～3 d內全部死亡；而非轉基因對照玉米處理組亞洲玉米螟存活率為89.00%～99.00%。

GAB-3心葉、雄穗、花絲、穗尖、籽粒等組織對棉鈴蟲有很強的抗性，取食GAB-3各組織的棉鈴蟲初孵幼蟲在測試2～5 d內全部死亡；而非轉基因對照玉米處理組棉鈴蟲存活率為80.00%～96.00%。

GAB-3心葉對草地貪夜蛾初孵幼蟲有很強的抗性，測試4 d后，幼蟲存活率為11.00%，存活的草地貪夜蛾也停止生長發育，處于1齡的狀態，而非轉基因對照組幼蟲已進入3齡，存活率為81.00%(圖1)。

A：取食GAB-3的幼蟲；B：取食非轉基因對照的幼蟲。A: Larva feeding on GAB-3 maize; B: Larva feeding on non-transgenic control maize.圖1 測試5 d后存活的草地貪夜蛾幼蟲 Fig.1 Larvae of Spodoptera frugiperda feeding on GAB-3 or non-transgenic control maize for 5 d

2.3 GAB-3對亞洲玉米螟和黏蟲的田間抗性

2.3.1心葉期GAB-3田間抗蟲性 田間接蟲14 d后調查結果顯示：轉基因玉米GAB-3接黏蟲和亞洲玉米螟后未觀察到任何為害癥狀，抗性等級為高抗；非轉基因對照和當地對照玉米為害較重，黏蟲的食葉級別達到2.78和3.71，抗性級別為抗蟲，亞洲玉米螟的食葉級別達到6.64和6.46，抗性水平為感蟲(表3)。表明心葉期轉基因玉米GAB-3對黏蟲和亞洲玉米螟有良好的抗蟲效果。

表3 心葉期GAB-3對黏蟲和亞洲玉米螟田間抗性Table 3 Resistance of GAB-3 to larvae of Mythimna seperata and Ostrinia nubilalis at whorl stage under artificial infestations in field

2.3.2吐絲期GAB-3田間抗蟲性 吐絲期玉米接亞洲玉米螟14 d后調查植株雌穗受害情況。調查結果表明，轉基因玉米GAB-3被害級別為1.06，抗性類型為高抗；其對應的非轉基因對照玉米和當地對照玉米被害級別為5.86和6.19，抗性類型均為感蟲(表4)。轉基因玉米單株蛀孔數、隧道長度及亞洲玉米螟活蟲數均為0，而非轉基因對照調查獲得單株活蟲數達到1.28頭，蛀孔數為1.02個，幾乎每一株都有被害。

表4 吐絲期GAB-3雌穗對亞洲玉米螟的田間抗性Table 4 Resistance of GAB-3 to larvae of Ostrinia nubilalis at silking stage under artificial field infestations

剖稈調查結果表明，轉基因玉米GAB-3莖稈無被害，而非轉基因對照玉米和當地對照玉米莖稈受害嚴重，非轉基因對照單株蛀孔數為0.71個，單株活蟲數為0.3個，單株隧道長度達1.39 cm；當地對照玉米單株蛀孔數達1.15個，單株活蟲數達0.45，單株隧道長度為1.36 cm(表5)。

表5 玉米莖稈受害情況Table 5 Maize stalk-damage level by lepidopteran pests under field conditions

綜合雌穗受害情況和莖稈受害情況，轉基因玉米GAB-3抗性顯著高于非轉基因對照玉米，在吐絲期對亞洲玉米螟具有良好抗蟲效果。

3 討論

Cry1和Cry2類Bt蛋白是轉基因抗蟲玉米中應用最廣泛的殺蟲蛋白，Cry1類對鱗翅目害蟲有殺蟲活性，Cry2類對鱗翅目和雙翅目昆蟲有殺蟲活性。Cry1類Bt蛋白中應用較多的有Cry1Ab和Cry1Ac，其中Cry1Ab在轉基因玉米中的推廣應用面積最大，比如Bt11、Bt176、MON810及其衍生品系等。Cry2Ab在殺蟲譜上與Cry1類殺蟲蛋白有所不同，并且在鱗翅目害蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上的結合位點不同[20]，因此，Cry2Ab常與Cry1類殺蟲蛋白組合使用，如MON89034同時表達Cry2Ab2和Cry1A.105，從而達到延緩害蟲抗性發展的目的。

在我國，第一代亞洲玉米螟的發生通常在春玉米心葉期，幼蟲主要取食幼嫩的心葉，葉片展開后會形成排孔，第二代玉米螟為害春玉米雄穗、花絲、穗軸和穗尖。在心葉期玉米田間抗蟲性試驗中，自然發生和人工接的亞洲玉米螟共同為害，導致非轉基因對照和當地對照玉米由于亞洲玉米螟取食造成的平均食葉級別達到6以上，而GAB-3未觀測到任何被害狀；在田間進行人工接黏蟲試驗中，接蟲3 d后在非轉基因玉米上觀察到黏蟲取食較多，但由于接蟲時期多雨，黏蟲未發育至暴食期大多已死亡，接蟲2周后調查顯示非轉基因玉米的為害并不嚴重，食葉級別為2.78和3.71，但依然高于轉基因玉米GAB-3(食葉級別為1)，顯示心葉期轉基因玉米GAB-3對黏蟲也有很高的抗性。

亞洲玉米螟除了取食玉米心葉，對玉米全株都可造成為害，吐絲期玉米田間接蟲試驗顯示GAB-3雌穗沒有明顯為害狀，未檢測到活蟲和蛀孔，而非轉基因對照玉米和當地對照玉米受害很嚴重，幾乎每一株都有被害。田間對玉米雌穗的調查發現，穗上的害蟲除了亞洲玉米螟外，桃蛀螟Conogethespunctiferalis的為害也非常嚴重。近年來，桃蛀螟在玉米上的為害逐年上升，已經成為夏玉米區穗期主要害蟲[4-5,21-22]。本研究中與非轉基因玉米上自然發生的桃蛀螟造成的嚴重為害相比，轉基因玉米GAB-3上幾乎沒有發生桃蛀螟的為害，這表明GAB-3也對桃蛀螟有很高的抗性。在穗期同時進行了剖稈調查，為害非轉基因玉米莖稈的害蟲主要有亞洲玉米螟和桃蛀螟，而GAB-3也沒有發生任何為害，顯示GAB-3全株對亞洲玉米螟和桃蛀螟都具有很高的抗性。

草地貪夜蛾侵入我國后，成為我國的又一玉米重大害蟲[7,23]，并且該害蟲對多種轉基因作物和農藥產生較強抗性，李國平等[24]研究顯示,入侵我國的草地貪夜蛾對Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A五種Bt蛋白未產生抗性，GAB-3對草地貪夜蛾的生測結果顯示取食GAB-3心葉的幼蟲死亡率顯著高于非轉基因對照組，并且存活的幼蟲停止生長發育，表明GAB-3在抗草地貪夜蛾上具有良好的應用前景。

隨著我國玉米種植面積的增加，玉米病蟲害發生一直呈加重趨勢，傳統化學農藥的應用帶來環境污染、抗性產生等等方面的問題。自1996年以來，國際上轉基因玉米的種植面積逐年增長，帶來了巨大的經濟和環境效益。我國于2020年1月21日發布2019年農業轉基因生物安全證書(生產應用) 批準清單，其中包括2個轉基因抗蟲玉米品種[25]，意味著我國在轉基因玉米商業化進程上邁出了重要一步。在轉基因玉米的研發上，我國各科研院所及企業一直在進行不懈的努力，目前已研制出多種具有良好抗性的轉基因玉米新品系。本研究表明，轉基因玉米GAB-3對玉米上五種鱗翅目害蟲具有很強的抗性，具有良好的生產應用前景。