枯草芽孢桿菌DNKAS對加工番茄分枝列當的防治應用

崔華星,王寧,侯敏,許俊鋒,郭文超,安康,陳陽輝,崔衛東*

(1.新疆大學生命科學與技術學院, 烏魯木齊 830001； 2.新疆農業科學院微生物應用研究所,烏魯木齊 830001；3.新疆農業科學院新疆特殊環境微生物試驗室， 烏魯木齊 830001；4.北京達農生物科技有限公司， 北京 100043)

分枝列當(Orobancheaegyptiaca)是多年生、兩年生或一年生肉質寄生草本，可廣泛寄生于西瓜、甜瓜、向日葵、加工番茄等作物上，會吸收寄主養分、生長激素和水分以維持自身生長，導致寄主作物生長緩慢、抵御病蟲害能力降低、作物產量和品質下降、減產甚至絕收[1-2]。新疆維吾爾自治區是受分枝列當肆虐最嚴重的地區之一，遍布南北疆各地，嚴重危害加工番茄種植加工產業，每年受分枝列當影響的加工番茄種植面積約為7 000 hm2 [3]，個別地塊寄生率達100%，導致加工番茄絕收。

目前，分枝列當主要防治措施有調整播期[4]、播種捕獲作物或誘捕作物[5]、土壤深耕[6]、培育抗性品種[7]、化學防治[8-9]等。然而，單一使用這些防治措施效果都不理想。調整播期和播種捕獲或誘捕作物雖然可以減輕列當危害，但在一些地區由于氣候原因很難執行；土壤深耕十幾年內只能用一次，防治效果降低；培育抗性品種是防治分枝列當的有效措施之一，由于我國對加工番茄抗分枝列當品種選育的研究相對滯后，且抗性品種影響加工番茄部分指標，形成成熟品種非常困難；化學防治不僅會污染土壤，而且劑量使用不當也會影響寄主作物生長[10]。微生物防治具有防治效果好[11]、環境友好、不易產生耐藥性、提高作物產量[12]、可在列當出土前進行防治[13]等特點，有利于發展可持續性農業，越來越引起人們的重視。

生防菌是防治列當的重要方法之一。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛應用于植物病防治，并取得良好效果，但用于列當防治的研究較少。了解枯草芽孢桿菌在大田中的代謝情況，有利于枯草芽孢桿菌對列當的防治應用。Biolog-ECO技術是根據微生物單一碳源代謝表型進行分析，通過對數字化的平板圖像進行顏色響應來研究微生物的代謝功能多樣性[14-15]。顧美英等[16]通過Biolog-ECO技術分析不同腐爛病發病程度核桃根區土壤，發現腐爛病發病程度較重的土壤中微生物活性低于健康和腐爛病發病程度較輕的土壤。當前，關于枯草芽孢桿菌在列當田中代謝情況研究，鮮有報導。本研究選用枯草芽孢桿菌DNKAS菌株作為生防菌，通過皿內種子發芽抑制試驗來驗證其抗列當性能，隨后為掌握大田中菌種施用的最佳劑量，從微生物群落系統功能角度，運用Biolog-ECO 技術分析不同處理條件下的土壤微生物功能多樣性、碳源利用情況和微生物代謝多樣性的關系，為枯草芽孢桿菌更好地防治分枝列當提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗菌株為枯草芽孢桿菌DNKAS，由北京達農生物科技有限公司提供；人工合成獨腳金內酯類似物GR24，購自北京酷來搏科技有限公司；DNKAS菌粉，由北京達農生物科技有限公司生產，施用劑型為可濕性粉劑，活菌數達 1×1011CFU·g-1；黃腐酸鉀，購自新疆雙龍腐植酸有限公司；番茄品種為‘TH1601’，由中糧吉木薩爾番茄公司提供；NA、NB和PDA培養基，均購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 樣品采集

試驗地點位于新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州吉木薩爾縣(N43°59′51″, E89°4′45″)，屬中溫帶大陸干旱氣候，冬季寒冷、夏季炎熱，降雨量少，晝夜溫差大，平均年日照時數為2 861.1 h，年平均氣溫7.0 ℃。品質檢測所用材料為各處理的成熟加工番茄果實，所需樣品土壤采集自去除表層深10～20 cm的根際土壤，四分法采樣后放入PE袋中帶回，放入4 ℃冰箱保存，用于微生物及土壤理化性質分析。

1.3 儀器與設備

SPX-420BF-2生化培養箱，上海福瑪試驗設備有限公司；1506Biolog-ECO 板和微生物自動鑒定系統，美國 Biolog 公司；JP-150Y超聲波細胞粉碎機，無錫久平儀器有限公司；L6S分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；DFY300A搗碎機，無錫萊浦儀器設備有限公司；TD-380折射儀，上海雙旭電子有限公司；YS6060番茄紅素色差儀，深圳市三恩時科技有限公司；CT-6321 pH計，上海儀電分析儀器有限公司；HK2玻璃糖漿錘度計, 濰坊祥意化工有限公司；MZ101體式顯微鏡，廣州市明美光電技術有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1皿內芽管生長抑制試驗 ①分枝列當種子的表面消毒和預培養。將分枝列當種子用質量體積比1∶100的次氯酸鈉溶液和75%的乙醇中分別超聲清洗5.0 min。用無菌水沖洗至無色后將分枝列當種子置于超凈工作臺自然晾干。先將直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于事先放有2層濕潤普通定性濾紙的直徑為9.0 cm的培養皿中，隨后將己經晾干的分枝列當種子均勻撒于玻璃纖維濾紙片上，每個濾紙片上約40～70粒種子。將上述培養皿封口后置于25 ℃的黑暗環境下培養5 d，待用。

②無細胞發酵液制備。首先，將DNKAS菌株接種于NA培養基中，于37 ℃培養24 h。隨后，挑取適量菌株接種至己滅菌、裝有50.0 mL NB培養基的200 mL三角瓶中。用培養膜封口后，將上述三角瓶放置于37 ℃、150 r·min-1的搖床中振蕩培養，同時以不接種微生物的NB液體培養基作為對照。振蕩培養18 h后，取三角瓶中的培養液30 mL，5 500 r·min-1離心7 min，離心后的菌液經0.45 nm微孔濾膜過濾。過濾后瓶中的無細胞發酵濾液視為原液。將無細胞發酵濾液原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。

③菌體水提取液制備。離心后的菌體加無菌水至30 mL，經超聲細胞粉碎機粉碎，粉碎后的菌液經0.45 nm的微孔膜過濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。

④菌體甲醇提取液制備。離心后的菌體加甲醇至30 mL, 經超聲細胞粉碎機粉碎，粉碎后的菌液經0.45 nm的微孔膜過濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。

列當芽管長度用明美顯微鏡成像系統自帶測量軟件進行測量。

⑤分枝列當種子芽管萌發試驗。萌發試驗設置4個處理，分別為0.1 mg·L-1GR24(GR24)、無細胞發酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)，其中，GR24為分支列當種子的萌發刺激物；菌體甲醇提取液為，取30 μL菌體甲醇提取液，待甲醇揮發后，加30 μL無菌水。同時，將無細胞發酵濾液、菌體水提取液和菌體甲醇提取液分別稀釋為1、10、100、1 000倍。將一片直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于培養皿中，依次添加30 μL種子萌發處理液和1片己經預培養好的分枝列當種子片于上述玻璃纖維濾紙片上。培養皿中部放1張對折3次的濕潤濾紙片保濕，然后將培養皿用封口膜封口。各處理6片重復。隨后將培養皿置于25 ℃黑暗環境下培養，9 d后，用顯微鏡觀察分枝列當種子芽管生長情況。

1.4.2田間小區試驗 設置清水對照(CK)、3 kg·hm-2DNKAS菌劑(D3)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑(D4.5)、6 kg·hm-2DNKAS菌劑(D6)、9 kg·hm-2DNKAS菌劑(D9)、12 kg·hm-2DNKAS菌劑(D12)、7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(FA-K)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑+7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(D4.5+ FA-K) 共8個處理，每個處理3次重復，共計27個小區，各小區隨機區組排列。每小區長70 m，寬1.5 m，面積 105 m2。各藥劑分4次隨水滴灌，時間分別為5月6日(番茄移栽時)、5月27日、6月7日、6月27日。待番茄生長中期分枝列當出土后，每小區全部采樣，調查分枝列當發生情況，計算寄生強度和防效。8月12日采收時，每小區取4.5 m2測產。

寄生數 = 鮮活分枝列當數+枯死分枝列當數

寄生強度 = 分枝列當總株數 / 被寄生的寄主株數

防治效果 =(對照寄生度-處理寄生度)/對照寄生度×100%

選擇色澤均勻、大小均一、成熟度一致的番茄紅色果實，每小區隨機取15個，每個果實縱切成4等份，各取其中的1/4放入搗碎機，以12 000 r·min-1轉速1 min勻漿，用于測定相關指標。可溶性固形物含量采用折射儀法[17]測定；可滴定酸含量采用NaOH滴定法[18]測定；a/b色差值采用番茄紅素色差儀[19]測定；粘度采用旋轉粘度測定法[20]；pH采用pH計測定；霉菌數采用稀釋平板涂布法[21]測定。

1.4.3土壤微生物群落碳源代謝利用測定 根際土壤微生物采用Biolog-ECO微平板方法[22]進行，并適當調整。選取防效效果好的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理，分別稱取各類土樣5 g，加入到裝有50 mL滅菌的無菌水中，置于28 ℃搖床上180 r·min-1振蕩30 min，使土壤充分混勻后靜置15 min，采用梯度稀釋法將土壤懸液稀釋至1 000倍。取上述土壤稀釋液150 μL接種到生態板中，并將接種好的Biolog-ECO板放置于28 ℃恒溫培養，分別在培養24、48、72、96、120、144、168 h時，用Biolog鑒定系統測定590 nm波長下的吸光度，將測得數據進行每孔平均顏色變化率(average well color development, AWCD)分析。

AWCD=∑(Ci-R)/31

式中，Ci是每個孔的吸光度，R是板內控制孔的吸光度。

選擇Biolog-Eco微平板培養120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的培養土壤懸液，進行6大類碳源利用情況分析；同時對土壤微生物檢測結果進行微生物群落功能多樣性分析，用Simpson指數、Shannon指數和McIntosh 指數來表征。

1.5 數據處理

數據預處理利用Microsoft Excel 2016，方差分析采用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)、Duncan法和Bonferroni法進行多重比較分析。主成分分析、多樣性指數分析采用DPS v9.50軟件。

2 結果與分析

2.1 不同處理對分枝列當芽管生長的影響

由表1可以看出，無細胞發酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)處理的分枝列當芽長均隨稀釋倍數的的升高而變長，同一種處理液的原液、10倍、100倍和1 000倍處理間均差異顯著。在稀釋倍數為1×、10×和100×時，CF、BM、BW三種處理溶液間均表現為BW和BM的分枝列當芽長顯著高于CF，表明CF的分枝列當芽長抑制效果優于BW和BM，稀釋倍數為1×、10×、100×的無細胞發酵液的分枝列當芽長抑制率分別為100%、83.85%和52.02%；稀釋倍數為1×、10×、100×的甲醇提取液的分枝列當芽長抑制率分別為83.07%、51.93%和34.19%；稀釋倍數為1×、10×和100×的水提取液的分枝列當芽長抑制率分別為72.40%、50.87%和27.81%；在稀釋倍數為1 000×時，CF、BM、BW三種處理溶液的分枝列當芽長無顯著差異，且與GR24處理間無差異顯著，即1 000×的CF、BM和BW處理對于分枝列當芽長無抑制作用。結果表明，枯草芽孢桿菌DNKAS可以抑制分枝列當芽管生長，其中，無細胞發酵液抑制效果最好，甲醇提取液次之，水提取液最弱。進一步證明，生防菌DNKAS對分枝列當抑制效果最佳的物質可能為細胞次生代謝產物，其次是胞內脂溶性物質，胞內水溶性物質抑制效果最差。

表1 不同處理的分枝列當芽長Table 1 Length of Orobanche aegyptiaca germ tube in different treatments (μm)

2.2 不同處理的小區防治效果

分枝列當的小區防治效果結果(表2)顯示，各處理均能顯著降低分枝列當的寄生數和寄生度，均具有良好的防治效果。其中，D12、D9、D6、D4.5、FA-K和D4.5+FA-K處理的防治效果分別為52.33%、47.89%、35.66%、28.03%、41.44%和47.22%，分枝列當寄生數分別降低52.36%、47.92%、35.65%、24.05%、41.44%、47.24%，寄生度分別降低52.20%、47.79%、35.66%、28.30%、41.17%、47.42%；6個處理間無顯著差異。D3的防治效果為24.09%，寄生數與CK相比無顯著差異，但寄生度較CK顯著降低了24.26%。可見，隨著菌劑劑量的加大，分枝列當寄生數量和寄生度均有明顯下降，防治效果有所提高。與FA-K相比，D4.5+FA-K的防治效果提高了14%，而寄生數和寄生度降低約10%，但是無顯著差異。與D4.5相比，D4.5+FA-K的防治效果顯著提高48.98%，寄生數和寄生度分別降低26.51%和26.67%，但是無顯著差異。

表2 不同處理的分枝列當防治效果Table 2 Control effectes of Orobanche aegyptiaca in field experiment of different treatments

2.3 不同處理對小區產量的影響

不同處理的小區產量結果(圖1)表明，各處理的加工番茄小區產量均顯著高于CK處理，均具有增產效果。其中，D4.5+FA-K處理的產量最高，為136 665 kg·hm-2，顯著高于D3、D4.5、D6、FA-K和CK處理，但是與D9、D12沒有顯著差異。D4.5+FA-K、D9和D12三個處理的產量較CK分別增加60.25%、56.48%和43.52%。純菌劑處理中，D12的產量最高，為133 445 kg·hm-2，與D9和D6間無顯著差異。D4.5、D3和FA-K處理的產量雖在幾個處理中最低，但是仍顯著高于CK處理，分別比CK顯著增加31.89%、22.96%和17.68%，可見，番茄產量與菌劑施用量存在一定的正相關關系。D4.5+FA-K與 FA-K相比顯著增產17.26%，與D4.5相比，產量顯著提高21.51%，表明黃腐酸鉀和菌劑混合施用，比單一施用黃腐酸鉀效果更好。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different lowercase letters indicate statistically significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖1 不同處理的小區產量Fig.1 Yield of plot in different treatments

2.4 不同處理對加工番茄果實品質的影響

番茄果實的品質性狀檢測結果(表3)顯示，各處理中，可溶固形物含量在4.5～5.0之間，粘稠度小于15，pH均在4.6以下，霉菌數為2，色差均大于2.0，符合國家標準[23]。表明添加菌劑和黃腐酸均未對果品產生不良影響。

表3 不同處理的番茄品質Table 3 Tomato quality indexes of processing tomato in different treatments

2.5 不同處理的根際土壤微生物功能多樣性

2.5.1根際土壤微生物群落的AWCD值

AWCD值越高，說明土壤微生物群落的代謝活性越旺盛。不同時間不同處理的AWCD值結果見圖2，可見，5個處理的AWCD值整體隨時間推移的變化趨勢一致，在培養24～120 h時，呈升高趨勢，120 h時達到峰值，表明此階段的土壤微生物數處于對數期，活性增加較快，利用碳源能力強；培養120 h之后，AWCD值逐漸下降，說明各個處理的微生物生長進入對數生長中后期，并且D9、D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的微生物數量均高于CK處理。不同處理的AWCD值存在一定差別。從0～168 h的AWCD值來看，土壤微生物群落代謝活性在120 h最高。與CK相比，D4.5+FA-K、FA-K、D12和D9處理的微生物活性依次增加了18.6%、10.2%、8.8%和3.4%。

圖2 不同處理的根際土壤微生物群落的AWCDFig.2 Microbial community AWCD of rhizosphere soil in different treatments

2.5.2根際微生物群落的碳源利用 根據不同處理AWCD值的變化情況，選擇120 h的根際土壤進行6類碳源的微生物利用分析，結果(圖3)顯示，D12處理的胺類、酚酸類、氨基酸和碳水化合物類利用情況高于D9，然而兩處理只有氨基酸利用情況低于CK。D12多聚物和羧酸類利用情況低于D9，但唯獨D12處理的羧酸類利用情況低于CK。D4.5+FA-K處理的6類碳源利用率均明顯高于FA-K，且D4.5+FA-K和FA-K處理的胺類、酚酸類、多聚物類和碳水化合物類利用情況均高于CK。D4.5+FA-K處理的羧酸類和氨基酸利用情況高于CK，但FA-K處理的羧酸類和氨基酸利用情況低于CK。

圖3 不同處理的根際土壤微生物群落對6類碳源的利用占比Fig.3 Utilization percentage of 6 types carbon sources by microbial communities of rhizosphere soil in different treatments

2.5.3根際微生物群落的微生物多樣性指數

優勢度指數、均勻度指數和豐富度指數是常用的群落多樣性分析指標。優勢度指數反映各物種的種群數量變化情況，指數越大，說明群落內物種數量分布越不均勻，優勢種的地位越突出。豐富度指數用于表征微生物群落的種類多樣性。均勻度指數用以反映土壤利用碳源種類和程度差異，均勻度越大表明微生物種群對碳源利用差異越大。對培養120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的AWCD值，進行微生物多樣性分析，結果(表4)顯示，D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的豐富度指數較高，顯著高于CK處理，但3個處理間無顯著差異。D9的豐富度指數與CK間無顯著差異，D4.5+FA-K的豐富度指數與FA-K無顯著差異。不同處理間的優勢度指數和均勻度指數均無顯著差異。結果表明，DNKAS菌劑和黃腐酸鉀均可增加根際土壤的微生物種類，但是對于建立菌群優勢地位和碳源的利用程度沒有影響。

表4 不同處理根際土壤的微生物多樣性指數Table 4 Microbial community diversity indexes in different treatmments

3 討論

目前，對于列當的微生物防治主要運用列當病原菌，能取得良好的防治效果。王亞嬌等[24]從感病的列當中分離出尖孢鐮刀菌Br-2，大田試驗顯示對彎管列當防治率高達58.27%。吳元華等[25]將自主分離純化得到的生防鐮刀菌用于煙田列當防治試驗，發現不僅可以推遲列當出土時間，還能達到62.44%的防治率。對土傳病害拮抗菌進行列當防治的研究較少。枯草芽孢桿菌對環境有較強的適應性，具有可在植物或土壤上大量繁殖和定植、競爭營養位點和空間位點、誘導抗性、促生和增產等特性，廣泛用于植物病害防治[26]，擁有作為列當生防菌的潛力。阻止列當芽管伸長，是列當防治的主要方式之一。本研究表明，枯草芽孢桿菌DNKAS的無細胞發酵液、菌體甲醇提取液、菌體水提取液對分枝列當的芽管生長具有顯著抑制作用。Barghouthi和Salman[27]研究發現，枯草芽胞桿菌QUBC16的無細胞發酵液可有效減少分枝列當芽管長度，與本研究結果一致。本研究中，無細胞發酵液對芽管生長抑制效果最佳，說明細胞次生代謝產物中有效物質起主要作用。然而是何種物質，還需進一步探究。

列當的寄生數量和寄主作物產量是評判生防菌防治效果的關鍵指標。已有研究表明，密旋鏈霉菌[12]和灰黃青霉[28]均可減少分枝列當萌發率，使列當寄生數下降，寄主作物產量增加。田間小區試驗表明，枯草芽孢桿菌DNKAS通過降低分枝列當寄生數量，使加工番茄增產。結合皿內試驗和田間小區研究發現，枯草芽孢桿菌DNKAS通過抑制分枝列當芽管生長，減少芽管與加工番茄根部接觸的概率，進而降低分枝列當出土數量，提高防治效果, 減輕分枝列當對加工番茄寄生的影響，使加工番茄增產。原因除了枯草芽孢桿菌可以減輕分枝列當的危害，還可能與枯草芽孢桿菌具有抗病、促生作用有關。基于田間小區試驗結果，枯草芽孢桿菌DNKAS的單次施用量低于4.5 kg·hm-2，不能形成優勢菌群，而高于12 kg·hm-2，菌劑成本太高，綜合考慮認為，合理的使用劑量為9～12 kg·hm-2。為降低人工成本和時間成本，建議用隨水滴灌藥劑進行防治。

Biolog-ECO微平板法是研究微生物對生態環境影響的重要方式。研究[29]發現，枯草芽孢桿菌Bs-15可使板栗土壤中微生物活性增加，顯著提高優勢度指數、均勻度指數和豐富度指數。本研究的Biolog-ECO微平板試驗發現，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均可增加土壤微生物活性、碳源總利用率、微生物數量和種類；同時，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀枯草芽孢桿菌DNKAS的微生物豐富度指數高于CK，而優勢度指數和均勻度指數與CK無顯著差異。表明枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均具有調整土壤微生物群落結構，使土壤中微生態功能更加趨于穩定的功能[29-30]。

目前，黃腐酸鉀在國內主要用于作物增產、提升品質和改良土壤，本研究發現黃腐酸鉀可用于列當的防治。研究表明，黃腐酸鉀具有促生、抗病、抗旱、提高過氧化物酶酶活等作用[31]，而根部土壤微生物群落結構的改變和過氧化物酶活性的升高，對列當寄生和生長有抑制作用[32]。因此，黃腐酸鉀可以減少分枝列當的寄生發生，促進加工番茄增產。