不同鈣磷配比及濃度對多花黑麥草生長特性的影響

徐彥紅, 左意才, 席溢, 許鐘丹, 李斌

(貴州大學動物科學學院, 貴陽 550025)

Ca作為植物必需的營養元素，有“植物細胞代謝的總調節者”之稱，能與作為胞內信使的Ca調蛋白結合，調節植物體的許多生理代謝過程[1-2]。P是植物生長發育不可缺少的營養元素之一，不僅是植物體內許多重要化合物的組分，而且還以多種途徑參與植物代謝[3]。多花黑麥草(Loliummultiflorum)為禾本科(Gramineae)一年生牧草，其再生性強、產量高、適口性好、品質優良，眾多草食動物喜食，可青飼、調制干草、青貯或放牧利用，是中國西南地區冬閑田栽培的主要牧草之一[4-5]。喀斯特地區特殊的碳酸鹽母巖成土背景和氣候條件，決定了其土壤有機質含量低、鈣(Ca)含量較高、保水保土能力差等特點[6-9]；且土壤中的磷(P)大多以難溶態形式存在，可以被植物直接吸收利用的有效P含量低。因此，喀斯特地區土壤多呈現高Ca、低P的特點，這是制約多花黑麥草生產的重要因素之一。因此，研究喀斯特地區多花黑麥草對高Ca、低P脅迫及不同鈣磷比(Ca/P比)的響應，具有重要的理論和應用價值。

關于植物對Ca元素、P元素響應的報道很多。吳鵬飛等[10]研究發現，隨著低P脅迫時間的推移，杉木的葉綠素含量發生大規模降低，不同濃度的Ca處理可以緩解低P逆境杉木葉綠體受傷程度，顯著提高其光合效率。低P脅迫下高粱的葉綠素和可溶性蛋白含量顯著下降，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)活性升高[11]。胡枝子在Ca脅迫下，SOD和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性隨著Ca濃度的增加，呈先降低后增加的趨勢，Ca濃度增加到100 mmol·L-1時，SOD和CAT活性降到最低，POD活性變化幅度較小[12]。可見，關于植物對鈣磷的響應多集中于單一Ca脅迫或P脅迫，而不同鈣磷配比及濃度對植物生長影響的報道鮮少，而不同鈣磷配比及濃度對多花黑麥草生長特性的研究，更是未見報道。因此，本研究以多花黑麥草(LoliummultiflorumLamk)為試驗材料，采用砂培法，探討了不同Ca、P處理對多花黑麥草株高、葉寬等形態指標以及光合色素、MDA、脯氨酸(proline, Pro)、SOD活性的影響，以期篩選多花黑麥草栽培的最適Ca、P濃度，解析多花黑麥草應對高Ca、低P環境的生理適應機制，為多年生黑麥草在喀斯特地區的種植提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以多花黑麥草‘安格斯1號’為研究材料，種子購自貴州眾智恒生態科技有限公司。

1.2 試驗方法

采用砂培法進行種植，石英砂用水浸泡，除去粘土和有機質，至水呈無色透明為止；再用3%鹽酸浸泡1周；然后用霍格蘭營養液浸泡，每天2次，至pH為中性。將處理好的石英砂裝入直徑為29.5 cm，深為21.5 cm的花盆中，每盆裝砂9 kg。

挑選均勻飽滿的黑麥草種子，將其置于2%的H2O2溶液中浸泡10 min進行消毒，再用蒸餾水沖洗6遍，晾干備用，將處理后的種子置床培養。待種子發芽，苗長7 cm以上時，選擇高度近似、生長情況相近的幼苗移栽花盆中，移栽深度為2 cm。為確保植株有足夠的養分，每周定期為植株澆灌霍格蘭營養液。

試驗共設置3個Ca/P比，依次為1∶1、2∶1、5∶1，每個Ca/P比設置2個水平，具體配置方法見表1，以不添加Ca、P離子的營養液處理為對照(CK)。每個處理種植3盆，每盆定苗3株。P源為NaH2PO4、Ca源為CaCl2。

表1 不同鈣磷處理的鈣、磷濃度設置Table 1 Designation of calcium and phosphorus treatments

1.3 測定項目及方法

株高和葉寬于2017年3月31日開始測量，每隔1周測量一次，共測量4周。

光合色素測定參照高俊鳳[13]的方法；MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[14]；Pro含量采用酸性茚三酮法[14]；SOD活性采用NBT光化還原法[15]。

采用隸屬函數法綜合評價鈣磷處理對多花黑麥草生長特性的影響，正相關的指標按Di=(xi-ximin)/(ximax-ximin)計算，負相關的指標按Di=1-(xi-ximin)/(ximax-ximin)計算。

式中Di為不同鈣磷處理下第i個指標的隸屬函數值，xi為不同鈣磷處理下第i個指標的值，ximax、ximin分別為不同鈣磷處理下第i個指標的最大值和最小值[16]。

1.4 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2013進行數據整理和繪圖，SPSS 20.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同鈣磷處理對多花黑麥草形態指標的影響

試驗過程中不同鈣磷處理的多花黑麥草株高和葉寬結果(表2)顯示，不同鈣磷處理間株高和葉寬有一定差異。試驗結束時，T2處理的株高最大，比CK高16.56%，但沒有顯著性差異；T3處理多花黑麥草的葉寬最大，比CK顯著高75.68%。T1和T2處理比較發現，Ca2+濃度為25 mg·kg-1時，隨P濃度的增加，株高呈上升趨勢，說明添加P會促進多花黑麥草生長，但4月14日之前葉寬呈降低趨勢，而4月14日之后葉寬呈升高趨勢。T3、T4和T5處理比較發現，Ca2+濃度為50 mg·kg-1時，隨P濃度增加，株高呈現不規則變化；4月14日之前葉寬呈先降低后升高趨勢，4月14日之后葉寬呈降低趨勢。T2和T4處理比較發現，P濃度為25 mg·kg-1時，隨Ca2+濃度增加，株高呈現增加趨勢，葉寬變化不規則。T5和T6處理比較發現，P濃度為50 mg·kg-1時，隨Ca2+濃度增加，株高呈降低趨勢。表明適宜的鈣磷濃度對多花黑麥草的生長有促進作用，Ca2+和P濃度分別為25、25 mg·kg-1時最佳。

表2 不同日期(mm/dd)不同鈣磷處理的株高和葉寬Table 2 Plant height and leaf width of different calcium and phosphorus treatments at different time(mm/dd) (cm)

2.2 不同鈣磷處理對多花黑麥草生理特性的影響

2.2.1不同鈣磷處理對光合色素含量的影響 不同鈣磷處理的多花黑麥草光合色素結果(表3)顯示，不同處理對光合色素的影響存在差異性。其中，T2處理葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均為最大值，且顯著高于其他處理(P<0.05)，較CK分別提高了12.22%、10.87%、14.63%。Ca/P比為1∶1時，隨著Ca2+、P濃度的提高，T5處理較T2處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量顯著下降。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時，隨P濃度增加，T2處理較T1處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著上升；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時，隨P濃度增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈先顯著降低(T3至T4)后顯著升高(T4至T5)趨勢。P濃度相同時，隨Ca2+濃度增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈降低趨勢(T2至T4，T5至T6)。表明適宜的鈣、磷濃度對多花黑麥草的光合作用有促進效果，Ca2+和P濃度分別為25 mg·kg-1、25 mg·kg-1時最佳。

表3 不同鈣磷處理對光合色素含量的影響Table 3 Photosynthetic pigment contents of different calcium and phosphorus treatments (mg·g-1)

2.2.2不同鈣磷處理對MDA、脯氨酸含量和SOD活性的影響 不同鈣磷處理多花黑麥草的MDA、脯氨酸含量和SOD活性結果見圖1,可見，CK處理的MDA含量最高，T1、T4、T5、T6處理間無顯著性差異，T2、T3處理最低。Ca/P比為5∶1時，隨Ca2+、P濃度的增加，T3處理較T1處理的MDA含量顯著下降；Ca/P比為2∶1時，隨Ca2+、P濃度的增加，T6處理與T4處理的MDA含量沒有顯著性差異；Ca/P比為1∶1時，隨Ca2+、P濃度的增加，T5處理較T2處理的MDA含量上升，但沒有顯著性差異。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時，隨P濃度增加，T2較T1的MDA含量顯著降低；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時，T3、T4、T5處理間MDA含量沒有顯著性差異。P濃度為25 mg·kg-1時，隨Ca2+濃度增加，T4較T2的MDA含量升高，但是沒有顯著性差異；P濃度為50 mg·kg-1時，T5、T6處理間沒有顯著性差異。表明Ca和P的缺乏對多花黑麥草造成傷害產生較多的MDA，在低濃度時對多花黑麥草傷害較小，而隨著脅迫濃度的增加傷害加重，產生更多MDA。

T2處理Pro含量最高，CK處理最低；Ca/P比為5∶1時，隨Ca2+、P濃度的增加，T3處理較T1處理的Pro含量顯著降低；Ca/P比為2∶1時，隨Ca2+、P濃度的增加，T6處理較T4處理間的Pro含量顯著升高；Ca/P比為1∶1時，隨Ca2+、P濃度的增加，T5處理較T2處理的Pro含量顯著下降。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時，隨P濃度增加，T2較T1的MDA含量顯著升高；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時，隨P濃度增加，Pro含量先顯著降低(T3至T4)后顯著升高(T4至T5)趨勢。P濃度為25 mg·kg-1時，隨Ca2+濃度增加，T4較T2的Pro含量顯著下降；P濃度為50 mg·kg-1時，隨Ca2+濃度增加， T5、T6處理間的Pro含量差異不顯著。表明在高Ca2+、P脅迫下，細胞滲透調節物質輔氨酸含量升高，但T2處理的輔氨酸含量最高，原因還需要進一步研究。

T5處理SOD活性最強，處理T1、T2、T3、T4、T6之間差異不顯著，且活性均較低。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時，隨P濃度增加，SOD活性增強(T1至T2)；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時，隨P濃度增加，SOD活性呈先降低后顯著升高；P濃度相同時，T2、T4處理間SOD活性無顯著差異，T6處理較T5處理SOD活性顯著下降。表明適當的Ca和P濃度會增加植物SOD活性，但脅迫過重SOD活性降低。

2.3 不同鈣磷處理對多花黑麥草生長特性影響的綜合評價

通過對上述指標的分析發現，多花黑麥草對不同Ca2+、P濃度存在一定的適應機制，在不同鈣磷處理下各生理指標的響應有差異。為探究多花黑麥草適宜生長的Ca/P比及Ca2+、P濃度，采用隸屬函數法對不同鈣磷處理下各指標進行綜合評價。以不同處理下各指標的平均值為基礎，用隸屬函數綜合評價公式，分別計算不同處理下多花黑麥草8個生理指標的隸屬函數值，將各項指標的隸屬函數值累加，取其平均值。結果(表4)表明，T3處理的隸屬函數值最大，T2處理次之，CK處理最差，表明Ca2+、P濃度分別為50、10 mg·kg-1處理下多花黑麥草的生長情況最好，Ca2+、P濃度都為25 mg·kg-1時，次之。

表4 不同鈣磷處理對多花黑麥草影響的隸屬函數綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of membership function of different treatments in L. multiflorum

3 討論

植株的高低是植物對逆境最直接的反映，葉片是植物光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉寬作為葉形指標，在植物逆境適應機制中有著一定的研究意義。本研究結果表明，Ca2+和P濃度都為25 mg·kg-1(Ca/P比為1∶1)時，多花黑麥草的株高和葉寬達到最大值。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時，P濃度低于和高于25 mg·kg-1，株高和葉寬均呈現下降趨勢。這與前人對蠶豆(Viciafaba)[17]、向日葵(Helianthusannuus)、玉米(Zeamays)和小麥(Triticumaestivum)[18]的研究結果一致，表明適宜的Ca2+和P離子濃度對多花黑麥草生長有促進作用，濃度過高或過低都會抑制其生長。

逆境脅迫下植物體內活性氧和過氧化物的積累會破壞葉綠素，導致其分解并抑制其合成。葉綠素含量直接影響光合作用的進行，在一定范圍內與光合速率呈正相關，能在一定程度上反映植物的光合能力[19]，而類胡蘿卜素含量的高低與植物耗散過量的激發光能有關。本研究發現，Ca2+濃度處于低水平(25 mg·kg-1)時，隨P濃度增加，葉綠素和類胡蘿卜素含量增加，而當Ca2+濃度為高水平(50 mg·kg-1)時，隨P濃度增加，光合色素含量先增加后降低，表明較高或較低的Ca2+、P會抑制光合色素的合成或加速光合色素的降解，本研究結果與Sabir等[20]對印度人參苗的研究結果相似。造成葉綠素含量降低可能是由于逆境脅迫打破離子平衡限制了鐵離子向原卟啉分子的運輸，類胡蘿卜素含量下降，也不利于植株耗散過量的激發光能，使光合器官的抗強光破壞能力降低[21]。

MDA作為膜脂過氧化產物，其含量的多少直接反映植物細胞發生膜質過氧化的程度。本研究中，CK的MDA含量最高，表明Ca2+、P的缺乏會導致多花黑麥草產生MDA，隨著Ca2+、P濃度的添加多花黑麥草細胞的膜質過氧化程度改善，但是當Ca2+、P濃度超過植物生長必需時，又會傷害植物細胞，高Ca、低P傷害效應疊加，加重多花黑麥草受損程度，表現為更多的MDA積累。抗氧化酶用于清除逆境脅迫誘導產生的過多活性氧自由基，保護細胞免受氧化性損傷，增強植物對逆境脅迫環境的適應[22-23]。本研究中，T5和對照(CK)的SOD活性較強，表明這兩個Ca2+、P濃度處理，誘導植物建立防御體系，從而避免或緩解了活性氧對植物的傷害；但是T6處理的SOD的活性又較弱，可能是較高的Ca2+濃度直接損害植物細胞引起的。 Pro是水溶性最大的氨基酸，可降低細胞水勢，防止脅迫造成的過度失水，在植物的滲透調節中起重要作用[24]。與CK相比，各處理的Pro含量均顯著升高，T2處理最高。滲透調節物質能夠緩解由于高濃度或低濃度Ca2+、P脅迫造成的細胞失水。

綜上所述，適宜的Ca/P比和Ca2+、P濃度可在一定程度上促進多花黑麥草株高和葉寬的提高。Ca2+、P脅迫條件下多花黑麥草可通過提高幼苗的滲透調節物質含量、增強酶活性的策略來適應逆境環境。隸屬函數法分析表明，Ca2+、P濃度分別為50、10 mg·kg-1處理最適合多花黑麥草的生長，Ca2+、P濃度都為25 mg·kg-1時，次之。可見，多花黑麥草對低磷有一定的耐受性，因此在喀斯特地區種植多花黑麥草時施入少量磷肥即可滿足其生長需要。為避免磷過量造成的資源浪費和水體污染，建議施磷量范圍為10～25 mg·kg-1。