陸地棉COR基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析及功能鑒定

李建平，足木熱木·吐爾遜，郝曉燕，常曉春，高升旗，胡文冉，陳 果，黃全生

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】 在植物的整個生長周期中，干旱、低溫和鹽堿等非生物因素限制其生長發(fā)育和生物產(chǎn)量。為了應(yīng)對和適應(yīng)這些不利的環(huán)境因素，植物從生化和生理層面不斷的進(jìn)行自我進(jìn)化[1]。當(dāng)前，發(fā)掘非生物脅迫誘導(dǎo)基因及其信號通路相關(guān)組分的工作取得了顯著進(jìn)展，發(fā)掘出許多與非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白，如與干旱脅迫、高鹽脅迫等相關(guān)的鈣依賴蛋白激酶(CDPK)家族[2]，ICE、CBF /DREB1及冷調(diào)控基因COR(cold regulated gene)家族與低溫脅迫有關(guān)[3,4]，促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAP激酶,MAPK)則在生物脅迫和非生物脅迫通路中均發(fā)揮功能[5,6]。不同的非生物脅迫因子對植物的生長發(fā)育所造成的影響是普遍而又特殊的[7]。近幾年，圍繞非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控生理機(jī)制，脅迫途徑相關(guān)功能基因、轉(zhuǎn)錄因子等的發(fā)掘及利用基因工程技術(shù)提高棉花的抗脅迫能力的研究工作逐步開始大量開展[8]。盡管棉花抗逆基因克隆和抗逆轉(zhuǎn)基因棉花研究取得了一定進(jìn)展，尤其一些冷脅迫相關(guān)基因被克隆，但其提高棉花低溫脅迫的作用機(jī)制還知之甚少?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花一般適合在溫暖的地區(qū)生長[9]，低于15℃的溫度會嚴(yán)重影響棉花的生長發(fā)育，使棉株容易感染真菌而誘發(fā)多種病癥，大田缺苗斷壟，導(dǎo)致減產(chǎn)[10]。棉花在整個生育期均容易遇到低溫脅迫，主要是在萌發(fā)期和苗期。棉花生長季節(jié)早期的低溫會對棉花幼苗造成嚴(yán)重傷害，在溫度恢復(fù)正常后棉株也可能無法完全恢復(fù)。Zhao 等[11]研究表明,短期低溫脅迫可能造成棉花葉片一定程度的生理障礙，當(dāng)這些經(jīng)低溫脅迫(白天16℃/ 夜間12℃或白天12℃/ 夜間8℃處理3 d) 后受傷的葉片進(jìn)一步接種鏈格孢菌時，棉花葉片出現(xiàn)葉斑病的明顯癥狀并呈發(fā)展趨勢，最終出現(xiàn)明顯的衰老癥狀。傳統(tǒng)育種方式對于新品種的培育周期過長，目前尚未培育出耐冷性能突出的新品種。近年來，新一代測序(Next generation sequencing，NGS)技術(shù)已應(yīng)用于全基因組表達(dá)譜研究[12-13]。Fernandez 等[14]利用轉(zhuǎn)錄組對參與向日葵響應(yīng)低溫脅迫的候選基因進(jìn)行了分析，有80個基因響應(yīng)早期的冷脅迫，這些基因分別擁有不同的功能-轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)折疊、ROS產(chǎn)生、ROS清除等。Park等[15]在轉(zhuǎn)錄組水平研究表明，棉花受水分脅迫后，519個轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出差異，其中有147個轉(zhuǎn)錄本有功能注釋，這些轉(zhuǎn)錄本中有70%參與以下4類功能中，分別為脅迫/ 防御型、代謝型、基因調(diào)控型及未明確分類型，其中熱激蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄本和活性氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄本最豐富。表明多倍體的棉花受水分脅迫后的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)涉及復(fù)雜的機(jī)制。國內(nèi)外利用分子生物學(xué)方法已經(jīng)克隆到一些棉花逆境脅迫響應(yīng)基因。Ma等[19]克隆了GhCBF基因，發(fā)現(xiàn)受到低溫脅迫誘導(dǎo)。2013年Xu等[20]發(fā)現(xiàn)來源于棉花的GhCAX3 在酵母和煙草中表達(dá)能顯著提高其抗冷性。Kargiotidou等[21]發(fā)現(xiàn)棉花FAD2-3和FAD2-4受到低溫誘導(dǎo)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管棉花抗逆基因克隆和抗逆轉(zhuǎn)基因棉花研究取得了一定進(jìn)展，尤其一些冷脅迫相關(guān)基因被克隆，但其提高棉花低溫脅迫的功能還知之甚少，尤其是陸地棉COR基因在棉花抗低溫脅迫中的功能研究目前尚鮮見報(bào)道。研究陸地棉COR基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析及功能鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于前人研究的結(jié)果及陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘與棉花耐低溫相關(guān)的COR候選基因，進(jìn)行克隆及功能驗(yàn)證，研究其作用機(jī)理，通過遺傳改良的方式培育耐冷棉花新品種。

1 材料與方法

1.1 材 料

陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1。

1.1.1 菌株與載體

大腸桿菌TransT1購自全式金生物，農(nóng)桿菌菌株GV3101為實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pEASY Blunt vector購自全式金生物， VIGS病毒載體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

1.1.2 試劑

所用的 PRIMESTAR DNA聚合酶購自Takara公司；TaqDNA聚合酶購自康為公司；M-MLV購自Invitrogen公司，各類限制性內(nèi)切酶及連接酶購自NEB公司；Trizol購自Invitrogene公司。Real-time PCR試劑盒購自ABI公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

陸地棉COR基因序列號及mRNA序列基于陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)及國際生物信息庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；Real-time PCR引物及VIGS引物設(shè)計(jì)基于Primer Premier 5.0完成。表1

1.2 方 法

1.2.1 棉苗種植及低溫處理

經(jīng)硫酸脫絨的棉籽置于用水浸濕的發(fā)芽紙上并用另一浸濕的發(fā)芽紙覆蓋密封，置于26～28℃的溫箱中放置4～6 d帶胚芽從棉籽中露出。在8.0×8.0(cm)的方形培養(yǎng)缽(商品化)中裝滿花卉營養(yǎng)土，并用自配Hoagland營養(yǎng)液浸透，將出芽狀況近似的棉種埋于營養(yǎng)土下約3～4 cm處。在23～25℃ 16h Light/8h Dark光周期下培養(yǎng)7～10 d至棉苗子葉展開但尚未長出真葉。按照一個處理每個品種種植30株，共計(jì)3個處理，在26℃ 16 h Light/8h Dark光周期下培育3周至發(fā)育出2～3片真葉，然后轉(zhuǎn)至10℃ 16 h Light/8h Dark處理0、3、6、12、24和48 h。分別在每個時間點(diǎn)取樣，提取總RNA備用。將3周苗齡的棉苗移至10℃進(jìn)行低溫脅迫處理。以低溫處理前的樣品為對照，分別在處理3、6、12、24及48 h時采樣，經(jīng)過總RNA提取、cDNA合成及實(shí)時熒光定量PCR等步驟，對候選基因受低溫誘導(dǎo)時的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.2.2 cDNA第一鏈合成依據(jù)Invitrogen公司M-MLV使用說明操作

Real-time PCR檢測依據(jù)ABI公司Real-time PCR試劑盒使用說明操作。

1.2.3 VIGS載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

根據(jù)Gh_D12G0215目的基因序列，在其保守區(qū)域選取一段300～600 bp的序列設(shè)計(jì)引物，并在正向引物5’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，反向引物5’端引入KpnI酶切位點(diǎn)，引物序列：Gh_D12G0215-VF:GGAATTCCTTCTCATCAGTTTTCTATCCT；Gh_D12G0215-VR:GGGGTACCGTAATGTGTGTCAGACTTCGG(下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn))。以棉花總RNA為模板，通過RT-PCR克隆目的片段，連接至pEASY Blunt vector并測序。將測序正確的克隆利用EcoRI與KpnI切酶從pEASY Blunt vector雙酶切并回收，連接至同樣經(jīng)EcoRI與KpnI酶切后的VIGS載體上，轉(zhuǎn)至GV3101農(nóng)桿菌中保存?zhèn)溆谩?/p>

以棉花cDNA為模版，PCR擴(kuò)增得到候選COR基因成員Gh_D12G0215的VIGS目的片段，將該片段回收后連接至pEASY blunt克隆載體上送測序公司測序。選取測序結(jié)果與原始序列完全一致的克隆提取質(zhì)粒，同時提取VIGS病毒載體質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切克隆載體和VIGS載體并回收。以T4DNA連接酶連接目的片段至VIGS載體，挑取陽性克隆并酶切鑒定。

1.2.4 目的基因沉默

VIGS操作方法詳見Gao 等[19]。

作為對照，將TRV:GhCLA1與TRV:RNAi共同侵染棉花子葉后，將棉苗在23℃避光環(huán)境下培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)至同樣溫度下12 h光照,12 h黑暗光周期下繼續(xù)生長7～10 d至真葉長出，觀察新長出的真葉是否出現(xiàn)白化表型，進(jìn)行的基因沉默操作結(jié)果是有效的。將基因沉默后的棉苗與對照共同在10℃下進(jìn)行低溫脅迫處理，觀察棉苗在低溫條件下的生長表現(xiàn)，并且將棉苗在低溫處理48 h后移至26℃恢復(fù)生長72 h統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.5 基因功能鑒定

將VIGS處理并已出現(xiàn)沉默效應(yīng)的棉苗移至10℃ 16 h Light/8 h Dark處理48 h，觀察表型并統(tǒng)計(jì)。

表1COR基因家族引物信息

Table 1 The information ofCORfamily member primers

引物名稱GenBank序列號引物序列(5'-3'方向)G0983-QFG0983-QRGh_A01G0983AAGGACCTGGATTTCGACTA AACTGCATTCCCTGCTACTCG1853-QFG1853-QRGh_A06G1853AGACTGTTCTCATTCTTTCGTGTTGGGTTGCTACATCCTTG0755-QFG0755-QRGh_A 09G0755TCGCAATGCACGAAATGTACCGCAGAAGAAATGGCGGAGAG0071-QFG0071-QRGh_D01G0071GACCCGTTGTTGAATAGCACCGAAACTTGACCGTTACTTGG1942-QFG1942-QRGh_D05G1942GAGGTGGTTGCTGGAAGAGTTCTCTGGTTGAAGCATTGG0147-QFG0147-QRGh_D06G0147ATACTGTTCTCATTCTTTCGTGTTGGGCTGCTACATCCTTG0215-QFG0215-QRGh_D12G0215GGAGAAAAGACCAGTTATGCTAATGTGTGTCAGACTTCGGG0756-QFG0756-QRGh_D09G0756ATGGATGAAGGGTGAATACCTGAGAAATGCTGGTAA內(nèi)參引物GhhistonGCCAAGCGTGTCACAATTATGCACATCACATTGAACCTACCACTACC

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉COR基因表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)

研究表明,部分COR基因家族成員響應(yīng)低溫誘導(dǎo)，基因表達(dá)發(fā)生不同程度的變化。基因序列號為Gh_D06G0147的COR基因受低溫脅迫基因表達(dá)受到顯著抑制，該基因在低溫脅迫中可能起負(fù)調(diào)控的作用；Gh_A09G0755在脅迫初期至6 h，基因表達(dá)上調(diào)了2倍，但是隨著脅迫時間的延伸，表達(dá)水平出現(xiàn)下降的趨勢，但是，在脅迫48 h后仍然達(dá)到對照的1.25倍，該基因可能參與了低溫脅迫調(diào)控；Gh_D12G0215在低溫脅迫作用下，隨著低溫處理的時間延長，基因表達(dá)水平逐步升高，在處理48 h后，表達(dá)水平達(dá)到對照的9.1倍，該基因受低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)非常明顯，可能在棉花低溫逆境條件下發(fā)揮一定的作用。其余COR基因家族成員的表達(dá)收到低溫脅迫的影響和對照相比無顯著的變化，但是并不表明這些基因的功能較弱，可能這些基因在其他逆境中如高溫、鹽脅迫中發(fā)揮作用。圖1

圖1 陸地棉COR基因家族成員低溫誘導(dǎo)下的表達(dá)

Fig.1 Relative expression analysis of differentCORgene family members induced by low temperature

2.2 COR基因的VIGS載體構(gòu)建

包含COR基因部分序列的VIGS載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌菌株GV3101中保存?zhèn)滢D(zhuǎn)化棉苗用。圖2

2.3 病毒誘導(dǎo)的COR基因沉默導(dǎo)致棉花對低溫脅迫更為敏感

將TRV:Gh_D12G0215與TRV:RNAi共同侵染棉花子葉，使棉花中的內(nèi)源COR基因Gh_D12G0215發(fā)生沉默。通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)GhCLA1及Gh_D12G0215的表達(dá)水平降低，該基因在棉花內(nèi)已被沉默。

研究表明,在相同的處理?xiàng)l件下，基因沉默后的棉苗存活率為31.09%，對照為53.27%，與對照相比，發(fā)生基因沉默的棉苗對低溫脅迫更為敏感，Gh_D12G0215基因可能參與調(diào)控棉花在低溫脅迫下的信號傳遞途徑。圖3

注：M為Trans2K DNA Marker，1為TRV:RNA2 空載體，2為TRV:Gh_D12G0215經(jīng)EcoRI與KpnI雙酶切后結(jié)果。載體片段為3 180 bp，目的片段大小為350 bp

Note: M, Trans2K DNA Marker; 1, TRV:RNA2 empty vector; 2, TRV:Gh_D12G0215 digested byEcoRIandKpnI.The length of vector fragment is 3,180 bp, and the length of target fragment is 350bp

圖2 TRV:Gh_D12G0215載體酶切鑒定

Fig. 2 The Double digested by EcoRI and KpnI result of TRV:Gh_D12G0215 construction vector

3 討 論

陸地棉是異源四倍體,基因組預(yù)測分析顯示,大約含7萬個基因[20],而雷蒙德氏棉基因組中約含3.7萬基因[21],需要建立高通量、準(zhǔn)確、易操作體系快速揭示基因功能。2008年，Gao等[22]通過VIGS方法抑制棉花抗黃萎病相關(guān)基因GhNDR1和GhMKK2表達(dá), 闡明了其在棉花抗病研究中利用潛力。近幾年，該技術(shù)在基因的功能研究方面被廣泛使用并得到國際認(rèn)可，故而VIGS技術(shù)具有簡單、快速、高通量、不受遺傳背景影響等優(yōu)點(diǎn),利用VIGS體系可高通量研究棉花基因功能,特別是快速查明表型明顯,作用大的重要質(zhì)量性狀基因,為目標(biāo)性狀基因的快速發(fā)掘與育種應(yīng)用提供重要基因資源與依據(jù)。研究中，同樣利用實(shí)驗(yàn)室建立的VIGS技術(shù)體系，驗(yàn)證了陸地棉COR基因在棉花受低溫脅迫時發(fā)揮一定的功能。研究中，除Gh_D12G0215的表達(dá)受低溫脅迫上調(diào)外，其它基因的表達(dá)或下調(diào)，或表達(dá)量出現(xiàn)短暫提高進(jìn)而有所降低，但是棉花中的其余COR家族成員是否在低溫脅迫或其它逆境脅迫中發(fā)揮一定的功能仍有待證明。

圖3 陸地棉Gh_D12G0215基因沉默植株在低溫脅迫下的表型及存活率

Fig. 3 Phenotype of silencedGh_D12G0215 seedlings after low temperature treatment

4 結(jié) 論

陸地棉COR基因家族受低溫脅迫基因表達(dá)各不相同，序列號為Gh_D06G0147的COR基因受低溫脅迫基因表達(dá)受到顯著抑制，基因表達(dá)水平低于對照，暗示該基因在低溫脅迫中可能起負(fù)調(diào)控的作用，但是實(shí)際功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證；Gh_A09G0755在脅迫初期至6 h，基因表達(dá)上調(diào)了2倍，但是隨著脅迫時間的延伸，表達(dá)水平出現(xiàn)下降的趨勢，在脅迫48 h后仍然達(dá)到對照的1.25倍，該基因可能參與了低溫脅迫調(diào)控；Gh_D12G0215在低溫脅迫作用下，隨著低溫處理的時間延長，基因表達(dá)水平逐步升高，在處理48 h后，表達(dá)水平達(dá)到對照的9.1倍，基因序列號為Gh_D12G0215的COR基因在棉花中沉默后，棉花對低溫脅迫表現(xiàn)的更為敏感，暗示著該基因可能參與了陸地棉在低溫脅迫下的調(diào)控。序列號為Gh_D12G0215的COR基因在棉花中沉默后，在低溫條件下的存活率僅為31.09%，顯著低于對照的存活率(對照存活率為53.27%)。通過表型觀察和統(tǒng)計(jì)，確定Gh_D12G0215參與了低溫脅迫下的調(diào)控。