降低樣品采集制備過程中土壤硝態氮和銨態氮測定誤差的方法

朱靖蓉，馬 磊，康 露，楊 濤，李 磐，蒲勝海，馬興旺

(1.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，烏魯木齊 830091；2.農業農村部西北綠洲農業環境重點實驗室,烏魯木齊 830091；3農業部農產品質量安全風險評估實驗室(烏魯木齊),烏魯木齊 830091；4.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

1 材料與方法

1.1 材 料

收集、整理相關文獻資料。

1.2 方 法

以追蹤主題詞相關內容蹤跡變化方法和統計方法分析文獻。

2 結果與分析

2.1 現行土壤硝態氮和銨態氮測定方法中易引起誤差的環節

2.1.1 實驗室測定步驟有嚴格誤差控制

土壤硝態氮、銨態氮含量測定常用方法有，在堿性介質中還原為氨后的蒸餾法或微量擴散法，在酸性介質顯色的酚二磺酸比色法等手工測定方法；以及儀器分析方法，如紫外分光光度法、硝酸離子選擇電極法、極譜法、離子色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳分析法以及流動注射分析法[4,5,14-17]。酚二磺酸比色法和靛酚藍比色法是土壤硝態氮、銨態氮含量測定的常規方法[4,5,18,19]，土壤硝態氮測定的國家標準方法是紫外分光光度法[20]，流動注射分析法的使用越來越普遍[12,21～27]。

實驗室測定土壤硝態氮、銨態氮的方法，無論是化學測定方法還是儀器分析方法，在實驗室進行的試劑配制、土壤樣品稱量、振蕩浸提、化學測定或儀器分析等過程和環節都有嚴格的規定，盡管不同方法中的浸提劑和浸提液中硝態氮、銨態氮濃度測定方法不同，但測定數據都有嚴格的誤差控制，數據之間有相關性。

2.1.2 土壤樣品采集和制備環節易引起測定數據誤差

上述方法均要求“采用新鮮土壤樣品”進行浸提，但對細節的描述不夠細致，操作性不強。比如，農業行業標準NY/T 1121.1-2006“土壤檢測-第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存”對新鮮土壤樣品的制備給出的規定是“為了能真實地反映土壤在田間自然狀態下的某些理化性狀，新鮮樣品要及時送回室內進行處理分析，用粗玻璃棒或塑料棒將樣品混勻后迅速稱樣測定。新鮮樣品一般不宜貯存，如需要暫時貯存，可將新鮮樣品裝入塑料袋，扎緊袋口，放在冰箱冷藏室或進行速凍保存”[28]。國家標準GB/T 32737-2016“土壤硝態氮的測定 紫外分光光度法”的規定更明確了，要求新鮮土壤“樣品采集后應于4℃下運輸和保存，并在3 d內分析完畢。否則，應于-20℃(深度冷凍)下保存，樣品中硝酸鹽氮和氨氮可以保存數周。當測定深度冷凍的硝酸鹽氮和氨氮含量時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4 h 內完成樣品解凍、勻質化和提取；如果在4℃下解凍，解凍時間不應超過48 h”[20]。國際上大多也是用新鮮土壤樣品分析無機氮，對樣品前處理的細節描述也不盡詳細[1-3]。可見樣品前處理，即新鮮土壤樣品的采集和制備環節步驟描述比較籠統很容易引起測定數據誤差。

實踐中，經常會遇到采樣點距實驗室遠、同一批次采樣數量大、采樣人員和設備不富裕等具體問題，造成按標準制備新鮮土樣有難度，況且該標準的規定本身彈性就大，不同研究者在新鮮土壤樣品的采集和制備過程中必然會出現操作差異，即使同一操作者制備的同一批樣品其制備條件也會有差異，必然會影響硝態氮、銨態氮測定結果的準確性和可比性。為了避免客觀條件造成的測定誤差過大，必須了解影響誤差的操作環節和原因。

2.2 土樣采集和保存過程對土壤硝態氮和銨態氮測定結果的影響

田間采樣時可能出現的情況有：采樣數量大，同一批樣品采集時間長；樣品不能及時送往實驗室，在田間放置時間長；樣品從田間送到實驗室的路途遙遠等情況。隨之產生的關鍵問題在于采集的新鮮土樣在室外放置，一定時間后測定的土壤硝態氮和銨態氮含量與采集時含量有多大差別。

2.2.1 土壤樣品采集后放置在室外會引起土壤硝態氮含量增加

幾十年前就已經發現土壤樣品采集后放置在室外會引起土壤硝態氮含量增加。有研究結果表明，新鮮土樣采集后密封保存在聚乙烯袋內，20℃下保存48 h硝態氮含量有輕微的變化，變化幅度在-1～1.6 mg/kg，保存超過48小時后硝態氮含量通常都增加，保存14 d后增加6～39 mg/kg[29]。用美國的石灰性土壤，以新鮮土壤樣在采集2小時后立即浸提的測定值為對照，新鮮土樣密封在塑料袋內在室外放置以模擬樣品從田間帶回室內的情景(每天有7 h日照，氣溫經常會超過40℃)，24 h后不同肥力土壤硝態氮含量的增加量在2.85～6.83 mg/kg，48 h后在5.54～12.99 mg/kg，7 d后在19.6～36.4 mg/kg，而且肥力越高的土壤硝態氮含量增加越多；密封放置在22℃室內的土壤硝態氮含量24 h會增加3.64～6.16 mg/kg，48 h后增加6.88～11.70 mg/kg，7 d后增加18.2～27.5 mg/kg[30]。

2.2.2 土樣低溫運輸也會引起引起土壤硝態氮和銨態氮含量變化

即使按照廣泛推薦并應用的方法[1,11,20,30]，采集的新鮮土壤樣品放在4℃的冷藏箱里運輸，這也不能完全避免土壤硝態氮和銨態氮含量的變化。Westfall把新鮮土樣放在4℃的冷藏箱中，土壤硝態氮含量24 h會增加1.18～3.27 mg/kg，48 h后增加2.29～6.04 mg/kg[30]。Ishaq A. Mian[31]發現即使采集的新鮮土壤樣品放在2～4℃冷藏，16 h后土壤硝態氮含量也比剛從田間采集時有明顯的增加，銨態氮含量降低，無機氮總量增加；當然不同肥力土壤中的硝態氮和銨態氮含量變化幅度不同。蘇濤[32]用陜西不同作物茬口土壤，分析冷藏土壤與鮮土樣硝態氮、銨態氮含量差值，認為隨冷藏時間延長土壤硝態氮、銨態氮含量較鮮土樣增加，且不同茬口土壤增加幅度不同。但楊樂蘇[33,34]用熱帶雨林土壤、高飛用北京耕地土壤，分析冷藏土樣硝態氮、銨態氮含量與鮮土樣含量的相對誤差，認為土樣在4℃冷藏后與鮮土樣硝態氮、銨態氮含量差異在可接受范圍。

可見，采集的新鮮土樣密封包裝后，無論是暴露在空氣中還是在冷藏箱里，一定時間后土壤硝態氮和銨態氮含量都會升高。土壤濕度和溫度是控制氮循環的兩個最重要的非生物因素[35]，硝態氮、銨態氮在土壤中的轉化始終在進行，土壤濕度、氣溫和田間放置時間等因素的綜合作用，會使土壤氮發生復雜的形態轉化，會進一步導致同一批樣品測定的硝態氮、銨態氮結果偏離“真值”、增大平行誤差。相對與暴露在室外環境下運輸，土樣放在冷藏箱里運輸時土壤硝態氮、銨態氮含量的變化要小的多。因此采集的新鮮土壤樣品應該放在4℃的冷藏箱里2 h內送回實驗室進行處理，這可以最大程度減小誤差；即使存在采樣時間長、路途遙遠等客觀限制，新鮮土樣應該以最快速度送回實驗室進行處理。

2.3 土樣的處理保存過程的影響

很多情況下受實驗室條件限制，采回的土樣不能立即浸提、測定，土樣要保存一段時間，而冷藏、冷凍、風干或烘干等不同的保存方式及保存時間長短會對硝態氮、銨態氮測定結果有不同的影響。

2.3.1 新鮮土樣、風干土樣和烘干土樣的測定結果差異較大

土壤礦質氮含量的變化主要是生物活動引起的，與土壤水分有很大關系，土壤水分含量高于萎蔫點硝化反應就會發生，氨化反應在低于萎蔫點就可以發生[36]。從降低土壤含水量，減弱或阻止土壤中氮含量變化方面有不少工作。

大多數研究的結果是,新鮮土壤風干后測定的硝態氮和銨態氮含量會增加。Nelson用pH5.5～7.8的10種土壤，新鮮土壤樣被迅速帶回實驗室后在22℃室溫下風干72 h后，土壤硝態氮和銨態氮分別平均增加1.7和4.2 mg/kg，風干土樣在室溫下密封保存1個月無機氮增加幅度不大，但隨后會緩慢增加[37]。朱靖蓉[27]選取新疆不同肥力的石灰性土壤灰漠土，風干土硝態氮、銨態氮含量明顯高于新鮮土含量。趙瑞芬[22]用山西大棚菜地土壤研究表明新鮮土經風干后土壤硝態氮和銨態氮含量有顯著增加。Ma等選取ph5.8～7.5的8種不同質地和肥力的土壤，新鮮土樣在2 h內浸提測定，同時新鮮土樣在22℃的室內風干24 h后密封保存在室內2個月，土壤硝態氮、銨態氮和無機氮含量均明顯增加，銨態氮比硝態氮增加的多，但是風干土與新鮮土樣測定結果之間有很好的相關性，可以用風干土測定結果估計新鮮土樣的無機氮含量，尤其是推斷硝態氮含量效果很好[11]。

也有研究顯示風干土硝態氮和銨態氮含量與新鮮土壤的相差不顯著或降低。宋建國[38]選取北方19種不同肥力土壤，新鮮土、風干土和烘干土之間土壤硝態氮、銨態氮數量差異不顯著，土壤銨態氮數量有所增加。孟盈用熱帶雨林土壤，新鮮土和風干土硝態氮、銨態氮含量差異不顯著，新鮮土和風干土硝態氮、銨態氮含量均顯著高于烘干土[39]；Ke-yi Li在春季和秋季采集陜西的10個土樣，風干土中的硝態氮含量較之于新鮮土平均減少了4.9%，銨態氮增加了30.0%[12]。

土壤烘干后硝態氮和銨態氮含量一般比風干土高，比新鮮土更高。Nelson用pH 5.5～7.8的10種土壤，新鮮土壤樣被迅速帶回實驗室在55℃烘干16 h，土壤硝態氮和銨態氮分別平均增加1.0和5.1 mg/kg[37]。趙瑞芬用山西大棚菜地土壤，新鮮土經烘干后土壤硝態氮、銨態氮和銨態氮含量有顯著增加，新鮮土<風干土<烘干土[22]。Ma等選取ph5.8～7.5的8種不同質地和肥力的土壤，新鮮土樣在2 h內浸提測定，同時新鮮土樣分別在20和40℃下通風干燥24 h，密封后在室溫22℃下放置2個月，土壤硝態氮和銨態氮均比新鮮土壤提高，兩種干燥溫度下的差別不大，但40℃烘干土的硝態氮和銨態氮含量更高[11]。

自然條件下土壤干濕交替是一種普遍現象，其作用往往會加速土壤氮素礦化過程[40]，鮮土樣經過風干后會引起土壤理化性質變化，土壤在干燥過程中溫度對土壤無機態氮的數量會有較大的影響[41]，土壤易礦化有機態氮的數量因處理溫度的不同而有較大差異[42]。不同土壤的性質導致結果不同，大批量樣品時烘干的工作量大不容易實現，風干能保存時間較長，但要得到風干土與新鮮土中硝態氮和銨態氮之間的相關關系是不容易的。因此以風干或烘干土壤的土壤硝態氮和銨態氮反映采樣時狀態不可行。

2.3.2 不同溫度冷凍保存后測定結果有差異

大多數研究表明新鮮土壤冷凍保存后硝態氮和銨態氮含量變化較小。Nelson用pH5.5-7.8的10種土壤，被迅速帶回實驗室的新鮮土壤樣在-5℃冷凍48 h后，土壤硝態氮和銨態氮平均分別增加0.4和0 mg/kg，保存9個月后也只增加了0.8和0.1 mg/kg，他認為只要冷凍前迅速處理，冷凍時放在密封袋里，融化時間足夠短，-5℃冷凍保存不會引起明顯的硝態氮和銨態氮含量變化[37]。楊樂蘇把熱帶雨林土壤在-6～-7℃冷凍保存，發現冷凍后土壤硝態氮、銨態氮含量與新鮮土樣含量相對誤差較小[33]。于天仁[43]發現在-15℃保存土樣硝態氮、銨態氮變化很小。Ma等選取ph5.8～7.5的8種不同質地和肥力的土壤，新鮮土樣在2 h內浸提測定，同時新鮮土壤密封后保存在-15℃，2個月后在室溫下4 h內解凍浸提測定，土壤硝態氮含量有明顯的增加，而銨態氮含量在幾種土壤中有增加也有降低[11]。但高飛和朱強用華北地區土壤發現-18℃冷凍后土壤硝態氮、銨態氮含量較鮮土樣增加38～262%，且不同土壤增加幅度不同[34,26]。土樣冷藏或冷凍主要是通過降低溫度使土壤中微生物生長速率和酶活性降低，從而減少土壤中氮形態間轉化，以降低硝態氮、銨態氮測定結果的差異。不同研究者的實驗條件和土壤肥力狀況不同，冷凍后土壤硝態氮和銨態氮含量變化的趨勢不盡相同，但大多數的結果說明新鮮土壤不能及時浸提測定時，冷凍保存是減少誤差的較好方法[27]，保存時間也不能太長，1個月內測定變化不顯著，盡可能在3個月內測定。

冷凍土壤的融化方式和時間對土壤中硝態氮和銨態氮含量有影響。M. J. Esala把質地和肥力不同土壤進行自然融化、研磨等，發現自然融化的方式導致的土壤硝態氮和銨態氮含量變化最小；在4℃以下融化時，4 h內不會導致土壤硝態氮和銨態氮含量的明顯變化，4～8 h就會有略微的增加[44]。所以冷凍土壤的土塊不要太大，盡可能在4℃以下4 h內化凍，使土壤達到均質化可以浸提的狀態。

2.4 土壤浸提過程對土壤硝態氮和銨態氮測定結果的影響

2.4.1 浸提劑和浸提時間長短不同時測定結果差異明顯

很多鹽可作為溶解性無機氮浸提劑，不同的浸提劑對土壤硝態氮、銨態氮測定結果有明顯的影響。王紅萍[45]認為2 mol/L KCl溶液、飽和CaSO4溶液、0.01 mol/L CaCl2溶液和去離子水浸提硝態氮無明顯差別，而浸提銨態氮差別明顯。朱強提出浸提潮土、黃棕壤及棕壤中的硝態氮、銨態氮時，0.01 mol/L CaCl2和2 mol/L KCl兩種浸提劑測定結果的相關性達到P<0.01 水平[26]。Houba[46]詳細綜述了0.01 mol/L CaCl2溶液在土壤養分測定的方法，它具有組成簡單、配制方便、易獲得澄清濾液、離子強度與土壤溶液相近等優點。Ke-yi Li提出0.01 mol/L CaCl2特別適合大批量樣品的浸提[12]。所以越來越多的文獻采用0.01 mol/L CaCl2溶液做浸提劑[47,48]。林業行業標準LY/T1228-2015規定酚二磺酸比色法測定土壤硝態氮用飽和硫酸鈣溶液浸提，靛酚藍比色法測定土壤銨態氮用2 mol/L KCl溶液浸提，連續流動注射分析儀法測定土壤硝態氮、銨態氮含量一般采用2 mol/L KCl溶液浸提[15]。國標GB/T32737-2016規定紫外分光光度法測定土壤硝態氮用1mol/L KCl溶液浸提[20]。

振蕩浸提時間對土壤硝態氮、銨態氮測定結果有影響。大多數文獻提到浸提硝態氮、銨態氮時振蕩時間為60 min。Ke-yi Li提出震蕩60 min就足夠了[12]。但有研究認為振蕩浸提30～60 min時，硝態氮和銨態氮的測定值相對穩定，測定的硝態氮、銨態氮濃度再沒有大差別，可以認為振蕩30 min時已能基本浸提出土壤中硝態氮和銨態氮，因此振蕩30 min即可[27]。

2.4.2 浸提液保存方式引起測定結果差異

浸提液保存方式對硝態氮、銨態氮測定結果有明顯影響。Ke-yi Li在春季和秋季采集陜西的10個土樣，較之于浸提后立刻測定的數值，浸提液在-18、4和25℃保存下，隨著時間延長，測定值會增加，即使保存2周測定值也有明顯增加，相對的，-18℃保存的浸提液測定值增加的較小[12]。高飛提出浸提液以常溫、冷藏和冷凍形式保存，7 d內硝態氮、銨態氮測定結果沒有顯著差異[34]。朱強提到浸提液在4℃和常溫下保存，短時間內兩者的硝態氮、銨態氮測定值沒有差別，但保存時間長則測定的硝態氮、銨態氮濃度會明顯增加；冷凍保存的浸提液測定的硝態氮、銨態氮濃度隨著土壤類型不同，有上升或下降的趨勢，大部分是升高[26]。可見浸提液在不同溫度保存時，也會引起硝態氮、銨態氮測定結果的不同。如果要積累大批量樣品進行批次測定，就必須考慮合適的浸提液保存方式。冷凍保存是比較好的方法。

3 討 論

3.1 要想室內測定得到采樣時田間狀態下的準確的土壤硝態氮和銨態氮含量是不可能的

土壤中無數的微生物和酶主導著氮的礦化和固定[49]，微生物生物量氮的活性及其消長被認為是土壤氮素內循環的本質性內容[50]，只要土壤濕度、溫度這些外部因素合適，土壤中氮不同形態間就進行轉化[35,36]。從操作實際看，無論是在土壤樣品采集運輸或實驗室保存，冷藏甚至冷凍也不能有效的阻止土壤中氮形態的轉化[30,51]，只是硝態氮和銨態氮含量變化的程度取決于土壤類型、肥力等。在土壤采樣、運輸、保存等前處理過程中，想要完全阻止土壤中氮形態間的轉化是不可能的，或者說想絕對的得到采樣時土壤硝態氮和銨態氮含量數據基本不可能。

3.2 改進前處理措施降低土壤硝態氮和銨態氮測定值與真實值之間的誤差是可能的

在土壤樣品采集、運輸、保存等環節，如果土壤溫度、濕度不能有效控制，會使測得的土壤硝態氮和銨態氮含量遠遠偏離采樣時的含量；但是如果把溫度、濕度以合適的方法控制在適當的范圍內，測得的土壤硝態氮和銨態氮含量會較小偏離采樣時的含量，甚至與采樣時的含量差異不顯著。關鍵是采用適當的土壤前處理和浸提液保存措施。

3.3 要建立一套適合各種氣候條件和土壤類型的通用的土壤前處理方法是有困難的

無論是不同的人采用低溫冷藏、常溫保存、低于零度的冷凍、風干、烘干等同一措施對不同的土壤研究，還是同一個人采用同一措施對不同土壤開展研究，同一措施在不同地方、不同肥力土壤的實驗結果不盡相同。說明了土壤中氮素轉化的復雜性，也說明為了減少或降低土壤前處理對土壤硝態氮和銨態氮測定的影響，應該在堅持原則一致的情況下，各地因地制宜制定土壤前處理改進措施。

4 結 論

4.1 降低新鮮土壤硝態氮和銨態氮含量測定值與真值間誤差的關鍵，是加快采樣、樣品儲運、浸提的速度，至少要嚴格遵照國家標準GB/T 32737-2016“土壤硝態氮的測定 紫外分光光度法”規定的時間要求。

4.2 采取以下土樣采集和制備方法可以使新鮮土壤硝態氮和銨態氮含量測定值與真值間誤差最小：田間采樣時土壤樣品密封后立刻放入4℃以下冷藏箱；2 h之內樣品冷藏送回實驗室進行浸提，否則-20℃保存土樣；冷凍時以小份、小塊保存，在3個月內測定完畢；冷凍樣品解凍盡可能在4 h內完成，使土壤達到均質化可以稱量的狀態；快速取樣、浸提，振蕩0.5 h到1小時即可；浸提液在4℃以下保存，2 h內測定完畢，否則浸提液在-20℃下冷凍保存。