隱球菌莢膜抗原膠體金免疫層析法在非HIV 患者隱球菌腦膜炎診斷中的價值

朱均昊， 趙 穎， 李 莉， 章強強

隱球菌腦膜炎是常見的真菌顱內感染，可發生于艾滋病和其他免疫功能低下人群，也可發生在免疫功能正常者[1]。過去認為隱球菌腦膜炎是艾滋病患者主要的機會性感染和常見的死亡原因，近年研究顯示中國高達50%～77%隱球菌腦膜炎患者為免疫功能正常者[2-3]。該病診斷困難，需依靠實驗室檢查，常規的腦脊液墨汁染色涂片和真菌培養陽性率低和耗時較長。膠體金免疫層析法（lateral flow immunoassay， LFA）近年被開發用于隱球菌檢測，與酶免疫測定和乳膠凝集試驗相比，對隱球菌莢膜多糖抗原有著更好的靈敏度和特異度，可用于隱球菌腦膜炎的快速診斷[4-5]。然而絕大多數的臨床研究都集中于艾滋病患者，對LFA在HIV陰性個體中的表現知之甚少。本實驗旨在評估該法在診斷中國HIV陰性成人隱球菌病的靈敏度和監控功能。

1 材料與方法

1.1 材料

所有3 627例患者都來自于復旦大學附屬華山醫院2013年1月－2018年8月的住院患者，均排除HIV感染。其中，男2 168例，女1 459例；年齡16～86歲，平均45.8歲。隱球菌性腦膜炎的診斷[2]，以患者腦脊液隱球菌墨汁涂片和/或培養陽性，或組織病理見隱球菌為確診；具備腦膜炎癥狀體征，腦脊液常規與生化檢查異常，腦脊液涂片和培養陰性，但隱球菌莢膜多糖抗原陽性為臨床診 斷。

為能合理評估實驗室檢查對隱球菌腦膜炎的診斷價值，避免抗真菌治療對檢查結果的影響，本研究剔除已抗真菌治療1個月以上的患者，收集首次診斷隱球菌腦膜炎患者病歷資料：初次的腦脊液常規和生化結果、墨汁涂片和培養結果，血和腦脊液的隱球菌莢膜多糖抗原滴度結果及HIV血清學結果。

1.2 方法

1.2.1 隱球菌LFA 采用隱球菌LFA檢測試劑條（美國Immuno-Mycologics公司生產）檢測患者的腦脊液標本。對隱球菌莢膜多糖抗原定性檢測陽性的標本進行半定量檢測滴度，若隱球菌抗原樣本稀釋1∶2 560出現強陽性結果，記錄隱球菌抗原滴度＞1∶2 560；若僅定性試驗陽性，稀釋后為陰性，隱球菌抗原滴度則為1∶2。

1.2.2 腦脊液的真菌培養 培養基采用沙氏葡萄糖瓊脂斜面，無菌條件下接種2管，分別置于25 ℃及37 ℃培養1周。

1.2.3 隱球菌墨汁染色鏡檢 將2 mL以上的腦脊液標本離心后，取沉淀與墨汁混勻鏡檢，在黑色背景下可見新型隱球菌周圍有一圈透亮的莢膜。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理和統計分析，針對隱球菌腦膜炎患者治療前后由LFA檢測獲得的隱球菌莢膜抗原滴度取常用對數后采用配對t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隱球菌LFA的靈敏度和特異度

在檢測的3 627例患者中，腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原陽性368例，其中確診或臨床診斷為隱球菌腦膜炎343例，24例為肺隱球菌病患者在排除中樞神經系統感染時發現腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原陽性，而墨汁涂片和培養陰性，診斷為隱球菌肺炎伴中樞神經系統感染可能，1例假陽性為自身免疫性腦炎患者。LFA的靈敏度為100%（367/367），特異度為99.97%（3 259/3 260）。

2.2 入院初次實驗室檢查結果

最終入選214例患者，初次診斷均為隱球菌腦膜炎，其中188例確診為隱球菌腦膜炎，26例為臨床診斷，見表1。

表1 隱球菌腦膜炎患者基本情況及實驗室資料Table 1 Demographic characteristics and laboratory data of patients with cryptococcal meningitis

表1（續）Table 1（continued）

患者的腦脊液總體呈現葡萄糖和氯化物水平顯著下降，蛋白含量增高，白細胞增多且以單核細胞為主的情況，49例患者的腦脊液葡萄糖未下降，經調查這部分的患者血糖值在（9.3±4.2） mmol/L，其中19例為明確的糖尿病患者。214例腦脊液隱球菌LFA檢測均都檢出隱球菌莢膜多糖抗原。腦脊液鏡檢和培養兩種方法的靈敏度分別為75.23%（161/214）和78.04%（167/214），結果見表2。

表2 膠體金法檢測陽性的214 例患者腦脊液培養和墨汁染色的結果Table 2 CSF culture and CSF ink staining for detection of Cryptococcus in the 214 patients positive in lateral flow immunoassay

2.3 腦脊液動態監測治療情況

通過分析病例資料，腦脊液墨汁涂片、培養及隱球菌莢膜多糖抗原對于病情的監測情況各不相同。在治療后，患者腦脊液培養保持陽性的中位時間是5.5 d（3～117 d），墨汁涂片保持陽性的中位時間是70.5 d（3～580 d），腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原保持陽性的中位時間是214 d（5～1 725 d），血隱球菌莢膜多糖抗原保持陽性的中位時間是300.5 d（36～1 843 d）。大多莢膜多糖抗原滴度隨治療時間的推移呈不規則的下降趨勢，因部分患者死亡、轉院等因素，對67例療程較長且仍在本院治療的患者治療6個月前后的4項實驗室檢查進行比較，其中腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原滴度和血莢膜多糖抗原進行比較時均對滴度值取常用對數后進行配對t檢驗，見表3。

表3 67 例長療程患者治療6 個月實驗室監測隱球菌腦膜炎療效Table 3 Laboratory monitoring of treatment efficacy in 67 patients with cryptococcal meningitis

3 討論

隱球菌腦膜炎具有臨床表現不典型、易誤診、病死率高等特點，因此早期診斷和及時治療對于患者的預后至關重要[1]。有研究表明，隱球菌腦膜炎的預后與發病到確診的時間顯著相關，因此需要更多的實驗室數據幫助診斷隱球菌腦膜炎[2]。

隱球菌腦膜炎患者腦脊液常表現為非化膿性改變，腦脊液生化表現為蛋白含量升高、葡萄糖、氯化物水平降低。本組80%左右患者腦脊液中葡萄糖、氯化物、蛋白發生了相應的改變，然而這與早期結核性腦膜炎的腦脊液改變相似，臨床診斷仍需要新型隱球菌感染的實驗室證據。

腦脊液或腦組織病原學檢查發現隱球菌是隱球菌腦膜炎診斷的金標準，腦脊液墨汁涂片是長期以來國內最常用的檢測方法，操作簡單，可快速、早期檢測隱球菌，檢出率在50%～90%[2-3，5]，對于HIV陰性的隱球菌腦膜炎患者，初次的墨汁涂片陽性率達到了75.23%，影響隱球菌檢出的主要原因可能與腦脊液中的菌量較少有關。腦脊液培養陽性同樣可以直接診斷隱球菌腦膜炎，但陽性培養時間長，需2～10 d，不利于快速診斷，本次是初次診斷的數據，腦脊液在沙氏培養基上陽性率達到了78.04%，與陽性率相關的因素是腦脊液的菌量負載和活力，此外患者一經抗真菌治療后，腦脊液培養會很快轉陰。一項系統性回顧表明，LFA檢測腦脊液中的隱球菌莢膜多糖抗原的靈敏度和特異度分別可以達到98.9%（95%CI，97.9%～99.5%）和98.9%（95%CI，98.0%～99.5%）[6]，本研究中，此方法的靈敏度為100%，特異度為99.97%，優于墨汁涂片和培養法。LFA只需要10 min即可獲得結果，避免了腦脊液培養耗時長的缺點，因其易觀察性，對操作員的要求不高；也避免了在墨汁涂片中因對隱球菌形態認識不足造成的假陰性，與其他免疫方法相比，LFA試劑在室溫下穩定，實驗室設備和人員的要求都不高，適合推廣。

隱球菌腦膜炎的治療療程較長，除了腦脊液常規、生化，腦脊液涂片和真菌培養在內的檢測手段，在治療后一般迅速轉為陰性，很難為臨床提供參考。本研究的統計中發現隱球菌腦膜炎在明確診斷開始治療后，在培養中位時間5 d左右就轉為陰性，墨汁染色的陽性在中位時間2個月左右消失。而臨床在初始治療后依然需要實驗室的檢測指標來密切觀察患者的治療情況，防止病情反復與復發。隱球菌LFA在疾病進展期抗原滴度會隨之增高，而臨床表現改善時則滴度下降的特性有助于了解患者病情變化和抗真菌藥物的療效[7]。本研究中，經有效治療半年后，67例隨訪患者的腦脊液和血隱球菌抗原隨著患者臨床癥狀的改善，滴度也呈下降趨勢，但抗原陽性有一定的滯后性。本研究中患者的腦脊液和血中的莢膜多糖抗原陽性最長可以維持近5年，可能是死亡的隱球菌持續釋放莢膜多糖抗原，或者部分患者清除抗原緩慢所致[8-9]，這使單純依賴抗原滴度來評估患者的治療有一定的局限性，不能作為終止治療的指標[10]。但血隱球菌莢膜多糖抗原檢測因為創傷小、易于采集，在觀察后續治療時得到了更廣泛的應 用。

對于肺部隱球菌病且免疫功能正常的患者，美國感染病學會2010年更新的指南指出，需要進行腰椎穿刺排除無癥狀的中樞神經系統感染，本結果也證實了部分隱球菌肺炎患者腰椎穿刺有腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原陽性，但滴度較低，范圍在1∶2～1∶20，均值在1∶10，腦脊液培養及鏡檢皆為陰性，但如果這部分患者有頭痛等癥狀，腦脊液生化有改變，仍需治療且同時進行隱球菌莢膜多糖抗原檢測的隨訪。

綜上所述，隱球菌腦膜炎患者腦脊液常規、生化有一定的特征性，當其發生異常時，臨床醫師應考慮患者隱球菌感染的可能性，并進一步加強隱球菌的病原學檢測。隱球菌LFA具有很高的靈敏度，與腦脊液的鏡檢和培養有高度的一致性，操作簡便省時，不需要復雜的實驗室設備，適用于隱球菌腦膜炎的快速篩查，提高疾病的早期診斷率，且用其作動態監測也有利于觀察病 情。