利奈唑胺耐藥糞腸球菌的耐藥機制與感染危險因素調查

鄒家齊， 夏 云

腸球菌廣泛分布于自然環境、人和動物的消化道。作為一種機會性感染病原體，可引起菌血癥，心內膜炎，腦膜炎，尿路、皮膚、軟組織和腹腔感染[1]。近年來，糞腸球菌已成為醫院感染的主要病原菌之一，其感染具有較高的發病率和病死率。由于糞腸球菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類等常用抗菌藥物天然耐藥，臨床上用于治療腸球菌感染的抗菌藥物有限，而萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）的出現進一步增加了治療的難度[2-3]。利奈唑胺作為新一代唑烷酮類抗菌藥物，于2007年在中國正式上市，主要用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、VRE及其他耐藥革蘭陽性菌的感染。利奈唑胺通過與50S核糖體亞基單位結合抑制細菌的生長，干擾蛋白質的合成，在體內和體外均具有良好的抗菌活性[3]。近年來有關利奈唑胺耐藥糞腸球菌（LRE）的報道在世界各地出現，且多重耐藥菌株的流行仍使腸球菌感染的治療面臨挑戰。雖然利奈唑胺耐藥監測結果報道世界范圍內利奈唑胺耐藥率低于2%[4-6]，但重慶醫科大學附屬第一醫院耐藥監測結果發現LRE的分離率逐年上升，從2011年的0上升至2018年的6.8%。本研究探討我院臨床分離LRE耐藥機制，并分析LRE感染相關的危險因素，為流行病學研究和臨床感染控制和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月－2018年12月我院住院患者無菌體液標本的非重復糞腸球菌1 902株。其中分離到85株LRE感染病例作為病例組，同時按照1∶1的比例隨機篩選出同期利奈唑胺敏感糞腸球菌（LSE）感染病例作為對照組。

1.2 儀器與試劑

PCR 擴增儀（美國A B I 公司），VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司），凝膠成像儀（美國伯樂公司）。細菌DNA提取試劑盒（美吉生物公司），PCR反應試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.3 細菌鑒定及藥敏試驗

全自動細菌鑒定系統和配套的藥敏鑒定卡對病例組和對照組的所有菌株進行15種常見抗菌藥物的藥敏檢測。利奈唑胺藥敏結果用微量肉湯稀釋法進行確認。判讀標準和結果解釋均參考2017年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）藥敏試驗指南[3]。質控菌株為糞腸球菌ATCC 29212。

1.4 利奈唑胺耐藥基因的檢測

參照試劑盒說明書提取細菌DNA。根據參考文獻設計引物[7-8]，包括23S rRNA V583 區片段，核糖體蛋白L3、L4，cfr、optrA和poxtA基因，PCR擴增完成后將陽性樣本送生工生物公司測序，最后與ATCC 29212標準序列比對，optrA基因與糞腸球菌E349基因序列比對。

1.5 病例及臨床數據收集

所有患者臨床數據是從醫院信息系統（HIS）和實驗室信息系統（LIS）收集。LRE感染患者根據《醫院感染診斷標準（試行）》為診斷依據確認醫院感染[9]。具體感染病種包括尿路感染、腹腔感染、切口感染、血流感染等，按照相關文獻中的標準進行[10-13]。 統計以下參數，比較病例組和對照組的潛在危險因素：①人口統計學（年齡和性別）；②住院特征（外院轉來、外科病房、入住ICU）；③基礎疾病及并發癥（惡性腫瘤、肝膽疾病、冠心病、呼吸系統疾病、糖尿病、尿路感染、真菌感染、胃腸道疾病、高血壓、腎臟疾病、周圍血管疾病、低蛋白血癥、低鉀血癥和嚴重貧血）；④復數菌感染（定義為同一患者存在 ≥2種細菌感染）；⑤侵襲性操作[手術史（6個月內）、氣管內插管、中心靜脈導管、引流管、導尿管、鼻導管、胃管、膀胱灌洗、腸外營養]；⑥抗菌藥物使用情況（青霉素、氨基糖苷類、廣譜頭孢菌素、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、糖肽類、大環內酯類、米諾環素等）。

1.6 統計學方法

使用SPSS 25.0統計軟件進行所有數據分析。相關數據資料通過卡方檢驗或Fisher精確概率法進行單因素分析，計算相關統計量用百分比（%）表示。單因素分析中P≤0.1的變量納入logistic回歸模型中，用于評估利奈唑胺耐藥的獨立危險因素。優勢比（OR）和95%置信區間（CI）以評估關聯的強度。P＜0.05為差異具有統計學意 義。

2 結果

2.1 臨床特征

收集的85例LRE感染患者中，尿路感染共29例（34.1%），15例患者近期（通常為 1 周）有內鏡檢查或留置導尿管史提示無癥狀性菌尿，臨床表現尿急、尿頻、排尿困難提示可能為急性膀胱炎8例，伴有發熱、畏寒、腰脅部疼痛、腎區叩痛提示腎盂腎炎6例；手術切口感染23例（27.1%）；腹腔感染19例（22.4%）；血流感染2例（2.4%）等。標本分布，85株LRE中，分離自尿液33株（38.8%），傷口分泌物16株（18.8%），引流液13株（15.3%），膽汁3株（3.5%）和血液2株（2.4%）等。科室分布，胃腸外科17株（20.0%），婦科14株（16.5%），泌尿外科9株（10.6%），ICU 9株（10.6%）等。

2.2 藥敏情況

所有LRE菌株都處于低水平耐藥，MIC在8～16 mg/L。我院耐藥監測結果顯示LRE的分離率逐年上升，2011－2018年從0明顯增長到6.8%（見圖1），85株LRE對青霉素、四環素、紅霉素、左氧氟沙星、莫西沙星和環丙沙星的耐藥率分別為7.1%、96.5%、94.1%、68.2%、62.3%和69.4%，而對替加環素、哌拉西林和萬古霉素均敏感。有56株 （65.9%） 屬于多重耐藥菌株（對3類或3類以上抗菌藥物耐藥）。

圖1 2011－2018 LRE 檢出率動態變化Figure 1 Changing prevalence of linezolid-resistant Enterococcus faecalis （LRE） from 2011 to 2018

2.3 耐藥基因檢測結果

85株LRE中98.8%菌株攜帶optrA基因。L3核糖體蛋白的突變分析鑒定出S113L（n=4，4.7%）；L4核糖體蛋白突變31株，其中有T35A（n=9，10.6%）、I98V（n=2，2.4%）、N79D（n=2，2.4%）和Q103缺失（n=18，21.2%）；另外還發現了新的L4突變位點E120G （n=1，1.2%）。而在85株LRE菌株中未發現23S rRNA結構域V區突變和甲基轉移酶基因cfr和poxtA的存在。

2.4 LRE感染單因素分析

單因素分析結果顯示，外院轉入、高齡（≥60歲）、惡性腫瘤、血管疾病、氣管插管和三個月內抗菌藥物暴露 （碳青霉烯類藥物）是LRE感染主要的危險因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 LRE 感染危險因素的單因素分析Table 1 Univariate analysis of risk factors for linezolid-resistant Enterococcus faecalis infection

表1（續）Table 1（continued）

2.5 LRE感染多因素分析

多變量logistic回歸分析確定外院轉入、高齡（≥60歲）、惡性腫瘤、氣管插管以及碳青霉烯類和氟喹諾酮類的先前治療是LRE感染的獨立危險因素。見表2。logistic回歸模型的Hosmer-Lemeshow檢驗表明數據擬合良好（χ2=7.7，df=8，P=0.46）。

表2 LRE 感染危險因素的logistics 回歸多因素分析Table 2 Multivariate logistic regression analysis of risk factors for linezolid-resistant Enterococcus faecalis infection

3 討論

近年來對于LRE的報道在全球范圍內逐年增多，2008－2016年美國SENTRY耐藥監測項目發現LRE總體耐藥率0.38%[4]。而我院耐藥監測結果發現LRE的分離率逐年上升，從2011年的0上升至2018年的6.8%。與其他研究結果一致的是，在本研究中觀察到由介導唑烷酮類的耐藥基因optrA（98.8%）是利奈唑胺耐藥的主要機制，這表明optrA可能通過質粒、轉座子、插入序列等可移動元件進行傳播的潛在風險[14-15]。前期研究中，對LRE（P10748）、LSE （3138）和標準菌株糞腸球菌ATCC 29212進行的轉錄組學測序和蛋白組學測序，證實了由optrA基因編碼的ABC轉運體（ATP binding cassette transporter）在糞腸球菌利奈唑胺耐藥中起重要作用[16-17]。在耐藥菌株中還發現與性信息素質粒相關的Sea1、TraB蛋白高表達，故推測optrA介導的耐藥可由性信息素調控而進行傳播。因此對于耐藥基因optrA的傳播機制有待進一步研究。文獻報道利奈唑胺耐藥機制具有地區差異性，在其他地區23S rRNA V583突變是對利奈唑胺耐藥的主要機制[18]，因此分析本地區的耐藥機制對于流行病學研究具有較高的價值。

對LRE感染的危險因素進行調查分析有助于預防感染，本研究發現與LSE組相比，LRE感染與從外院轉入獨立相關。可以推測外院轉入的患者可能由于復雜的病情和更嚴重的臨床癥狀而住院時間更長，并且這些患者中大多數可能具有更高接觸醫院病原體和接受抗生素治療的頻率[19]。老年人和患惡性腫瘤的患者由于免疫功能低下，感染LRE機會較大[20]。而氣管插管作為獨立危險因素的合理推測是氣管插管容易引起患者呼吸道黏膜損傷，機械刺激可導致防御屏障的損壞，從而降低防御效果，并且通過支氣管導管通路將病原體直接引導到體內。這些患者的免疫功能狀態較差，導致感染發展的風險也較高。

與LSE組相比，LRE感染的獲得與抗菌藥物先前使用有關，包括碳青霉烯類和氟喹諾酮類藥物。可能的解釋是廣譜抗生素的治療可能導致胃腸道菌群紊亂，感染的機會就越大。另外，盡管有研究表明，細菌對利奈唑胺耐藥的產生與利奈唑胺長期暴露有關[21]。然而，在本院分離的85例LRE感染患者住院期間并沒有明確的利奈唑胺治療史，提示利奈唑胺暴露與其獲得性耐藥之間沒有明顯相關性[22]。綜上所述，本研究動態監測到LRE分離率的明顯上升，并發現攜帶optrA基因為主要的耐藥機制。初步探究了我院LRE感染的臨床特征危險因素，發現從外院轉入、惡性腫瘤、氣管插管、碳青霉烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物先前使用是導致LRE感染的獨立危險因素。可望更多樣本的多中心研究更全面揭示本地區LRE耐藥機制及感染的危險因素。