中國侵襲性真菌耐藥監測網成員單位重癥監護室侵襲性酵母的分布特征及其對唑類藥物敏感性的變遷

井 然， 侯 欣， 肖 盟， 康 梅， 陳淑蘭， 李若瑜， 羅燕萍， 孫自鏞， 廖 康，馮羨菊， 胡志東， 潘玉紅0，褚云卓，梅亞寧，劉文恩，楊 青，蘇丹虹，鄒桂玲，俞云松，劉麗文，胡辛蘭，周鐵麗0，張 嶸，喻 華，邵海楓，倪語星，王 勇，宋秀蘭，侯鐵英，呂火祥，徐修禮，張智潔0，賈 偉，李克誠，馬 玲，李國雄，鄧林強，孟 靈，宋衛青，徐元宏，王 晶，許小敏0，張 瓊，章強強，楊 濱，雷金娥，徐英春

近年來對侵襲性念珠菌病的流行病學研究發現，白念珠菌是引起侵襲性念珠菌病的主要病原體，但非白念珠菌的分離率逐漸升高且耐藥率往往高于白念珠菌，特別是光滑念珠菌對唑類藥物的敏感性逐漸降低[1-2]。對侵襲性酵母病患者進行準確診斷和早期合理的抗真菌治療至關重要[3-4]。本研究收集2010－2014年中國侵襲性真菌耐藥監測網（CHIF-NET）成員單位重癥監護室（ICU） 侵襲性酵母菌株，對菌株進行菌種復核鑒定；同時，分析其對唑類藥物的敏感性，為我國侵襲性酵母感染的臨床診治提供參考依據[5]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究的菌株均來自CHIF-NET 2010－2014年62所監測中心ICU分離到的所有引起侵襲性感染的酵母，共計2 863株。標本類型包括血液、腹水、腦脊液、胸水等無菌體液。

1.2 菌種復核鑒定

以法國生物梅里埃公司的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）鑒定為主，與分子生物學方法相結合，對酵母rDNA的ITS區域或28S rRNA的D1/D2區測序，從而對酵母進行菌種復核鑒定，并比較菌株的復核鑒定正確 率。

1.3 藥物敏感性檢測

依據CLSI M60紙片擴散法中現有的一些常見念珠菌的藥敏折點對兩種唑類藥物氟康唑和伏立康唑的藥敏結果進行判讀[6]，對沒有藥敏折點的其他酵母，則依據CLSI M44-S3標準進行藥敏結果判讀[7]。近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為藥敏試驗的質控菌株[6]。

1.4 統計學分析

用SPSS 12.0統計學軟件進行分析。連續變量的比較采用Mann-Whitney檢驗；類別變量的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌種分布

收集5年間來自中國62所監測中心ICU的菌株，總計2 863株。其中，念珠菌屬2 771株，占96.8%；隱球菌屬39株，占1.4%；毛孢子菌屬17株，占0.6%；其他非常見酵母36株，占1.3%。在念珠菌屬中，最終復核鑒定到22個種 /復合體；其中，常見念珠菌屬中以白念珠菌為主，占44.5%（1 234/2 771）；其次是熱帶念珠菌，占16.9%（467/2 771）；近平滑念珠菌和光滑念珠菌分別占18.6%（515/2 771）和12.3%（340/2 771）。在隱球菌屬中，新型隱球菌復合體占9 4.9%（37/39）；其次，在毛孢子菌屬中，以阿薩希毛孢子菌為主，占76.5%（13/17）；其他非常見酵母中，以膠紅酵母為主，占47.2%（17/36）。

2.2 菌種復核鑒定情況

對2 863株酵母進行質譜和分子測序復核鑒定，結果顯示復核鑒定結果正確率為86.2%（2 467/2 863），錯誤率為11.6%（332/2 863），其余64株菌復核鑒定的結果存在不確定性，占2.2%。白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌復合體的復核鑒定正確率較高（83.7%～97.8%）。但其余352株罕見酵母的復核鑒定正確率僅為40.3%（142/352）。

2.3 標本類型分布

2 863株酵母分離自血液等12種無菌體液標本，50.8%（1 453/2 863）菌株分離自血液，其次分離自腹水（22.1%，632/2 863）和靜脈導管（9.2%，263/2 863）。念珠菌屬中1 404株分離自血液，占血液標本的96.6%，其他無菌體液標本也分離出念珠菌屬，如腹水（621/632，98.3%）、靜脈導管（259/263，98.5%）等；其次，48.7%（1 9/3 9）隱球菌屬分離自腦脊液；6 4.7%（11/17）和23.5%（4/17）毛孢子菌屬分別分離自血液和腹水。ICU分離的侵襲性酵母菌種標本類型分布見表1。

2.4 酵母對唑類藥物敏感性

對2 863株酵母的唑類藥物敏感性檢測結果進行分析，白念珠菌對氟康唑和伏立康唑敏感，敏感率＞99.0%；近平滑念珠菌對氟康唑耐藥率為8.7%（45/515），對伏立康耐藥率較低，為4.7%（24/515）；相比之下，光滑念珠菌對氟康唑耐藥率較高，為21.8%（74/340）；熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率較高，均為14.1%（66/467）。克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥[6]；94.6%（35/37）克柔念珠菌對伏立康唑敏感，5.4%（2/37）中介。見表2。

非念珠菌屬中，新型隱球菌復合體對伏立康唑全部敏感；除黏性絲包酵母（Trichosporon mucoides）和弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）等對氟康唑和伏立康唑全部敏感外，其他酵母對氟康唑和伏立康唑耐藥率整體較高，分別為43.6% （24/55）和32.7% （18/55）。見表2。

在氟康唑耐藥的熱帶念珠菌中，有98.5%（65/66）對伏立康唑也耐藥；鏈狀念珠菌和膠紅酵母也出現交叉耐藥。

表1 2 863 株ICU 侵襲性酵母菌種標本類型分布及構成比Tab1e 1 Specimen distribution of 2863 strains of invasive yeast isolates from ICUs in terms of species[n（ %）]

表2 2 863 株ICU 侵襲性酵母對氟康唑和伏立康唑的耐藥性歷年變化趨勢Table 2 Changing resistance profile of 2 863 strains of ICU-derived invasive yeasts to fluconazole and voriconazole

2010－2014年5年間變化趨勢顯示，熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率顯著升高，均從12.2%升至23.1%（P＜0.01）；光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率也顯著升高，從14.7%升至27.7%（P＜0.01）。

2013年開始分離出對氟康唑耐藥的新型隱球菌復合體（見表2）和毛孢子菌屬；2014年開始分離出對伏立康唑耐藥的毛孢子菌屬。

3 討論

ICU患者發生念珠菌血癥和侵襲性念珠菌病可導致高病死率（35%～67%）[8]，一項北美研究顯示念珠菌血癥患者會發生感染性休克和多器官功能衰竭，且60%因念珠菌血癥導致感染性休克的患者在28 d內的病死率高[9]。美國和西班牙監測研究顯示ICU發生念珠菌血癥的患者占總共納入研究的念珠菌血癥患者的1/3[10-11]；從2004－2006年，英國每10 000例ICU患者中有4.9%～9.1%為侵襲性念珠菌病患者[12]。免疫抑制的ICU危重患者念珠菌血癥和侵襲性念珠菌病的危險因素包括長期接受化療，使用廣譜抗生素，植入中心靜脈導管、留置針，接受腎透析、呼吸機和腸外營養等[8]。一項從2007－2016年法國尼姆大學附屬醫院的ICU念珠菌菌種分布研究顯示，分離出的念珠菌屬占總分離菌株的96%，以白念珠菌為主（55.8%），其次是光滑念珠菌占14.4%，熱帶念珠菌占10%。其中，43%和22.1%念珠菌分別分離自腹水和血液[13]，以腹腔內感染為主。與法國的研究相比，本研究結果顯示我國ICU侵襲性真菌感染分離菌株以念株菌屬為主，主要分離自血液標本。

本研究中菌種復核鑒定的正確率為86.2%，特別是罕見菌種的復核鑒定正確率較低。質譜結合分子測序方法復核鑒定酵母菌種在CHIF-NET研究中發揮重要作用，但由于價格昂貴，缺乏標準方法和質量控制等，對于基層醫院全面開展存在一定困難。對于鑒定結果不確定或難鑒定的菌種，可通過分子生物學方法進行復核鑒定。

5年間，白念珠菌對兩種唑類藥物保持高度敏感，而熱帶念珠菌和光滑念珠菌的耐藥率顯著升高；克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥[6]，對伏立康唑基本敏感；熱帶念珠菌、鏈狀念珠菌和膠紅酵母出現交叉耐藥。逐漸出現新型隱球菌復合體對氟康唑耐藥，這與CHIF-NET（2009－2014年）的一項新型隱球菌復合體藥敏結果分析一致[14]。目前，CLSI M60的紙片擴散法[6]僅對白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌有藥敏折點判斷標準，對于其他念珠菌還需依據CLSI M44-S3來判斷[7]；此外，紙片擴散法中沒有流行病學界值，無法判斷野生型和非野生型；基于紙片擴散法和微量肉湯稀釋法有較好的相關性[15-16]，所以只能參照CLSI M44-S3來判斷非念珠菌屬的藥敏結果。

綜上所述，念珠菌屬是我國ICU侵襲性真菌感染的主要酵母，以血流感染為主；5年間，白念珠菌是最常見的侵襲性念珠菌，但氟康唑和伏立康唑對其作用非常顯著；而非白念珠菌的耐藥率有不同程度的升高及交叉耐藥的出現，臨床需要加以重視。本研究結果有助于我國臨床醫師合理地篩選抗真菌藥物，針對性治療ICU侵襲性酵母感染的患 者。