東鄉野生稻稻曲病人工接種技術研究

胡建坤,黃 蓉,李湘民,劉永鋒,廖泰珍,黃瑞榮*

(1.江西省農業科學院 植物保護研究所,江西 南昌 330200;2.江蘇省農業科學院 植物保護研究所,江蘇 南京 210014;3.江西省寧都縣農業農村局,江西 寧都 342800)

東鄉野生稻(OryzarufipogonGriff.)具有宿根(多年生),再生力和繁殖(無性)力強,耐旱、耐貧瘠及多種抗逆性等有利性狀，它還含胞質不育基因、廣親和基因、恢復基因、抗病蟲基因等多種有利基因[1-2]。其中,其耐冷基因在水稻育種上最先取得了實際應用,已選育出在南昌自然條件下越年生粳稻品種(品系)4913-1[3-4]。姜文正等[5]指出東鄉野生稻9個群落的抗病性各不相同,多數群落對黃矮病免疫,抗白葉枯病、稻瘟病；半數以上群落對白葉枯病、細條病表現多抗。黃瑞榮等[6-7]對東鄉野生稻在較多材料來源的基礎上進行抗病性鑒定,發現東鄉野生稻感稻瘟病,但對白葉枯病和細條病抗性好,同時發現有5份材料對以上3種病害均表現抗性,為理想的抗源材料。然而,東鄉野生稻對稻曲病的抗性情況尚不清楚。

高效、準確的人工接種技術可以減少抗性鑒定工作中客觀條件的影響和限制,增加鑒定工作的可靠性,加快鑒定工作的進行。對于常規栽培水稻,張君成等[8]、王疏等[9]、林瑜凡等[10]在接種體、接種方法、接種濃度、接種水稻生育時期等多方面做過深入而全面的研究,形成了比較成熟可靠的人工接種技術。但東鄉野生稻與常規栽培稻在生物學性狀、生理生化及生長生育等方面存在著一定的差異,東鄉野生稻不同單株間也存在生物學性狀的不同,因此現有稻曲病人工接種技術是否在東鄉野生稻上適用尚不確定。本試驗選擇3株東鄉野生稻單株作為接種材料,重點研究了水稻生長時期、接種體、接種時間、接種方法等4個因素對接種效果的影響,以期獲得成熟的東鄉野生稻人工接種技術,為開展東鄉野生稻抗稻曲病的研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試水稻的種植與管理

1.1.1 東鄉野生稻的種植與管理 由于東鄉野生稻不同單株間抽穗量及抽穗時間不同,因此為方便接種技術研究的開展,同時驗證該技術在東鄉野生稻上的適用性,從107份東鄉野生稻單株中選擇3株抽穗較多、抽穗時間較為一致的單株DX13(A)、DX35(B)和DX67(C)進行研究,每個單株種植10叢,分別編號為A1、A2,…,A10;B1、B2,…,B10;C1、C2,…,C10。東鄉野生稻單株在自然條件下按常規方法進行管理,防治蟲害但不防治病害。

1.1.2 兩優培九的種植與管理 以感病栽培水稻兩優培九作為對照品種。兩優培九于6月5日播種第一批,之后每隔7 d播種1批,共播種5批。移栽秧齡35 d,每批移栽10行,每行8叢,株行距21 cm×25 cm;設保護行和工作行。兩優培九在自然條件下按常規方法進行管理,防治蟲害但并不防治病害。

1.2 稻曲病菌菌株

供試強致病力稻曲病菌菌株UvB367由江蘇省農業科學院植物保護研究所劉永鋒研究員提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 東鄉野生稻不同生長時期人工接種試驗 采用注射接種方法,以菌絲片段-分生孢子混合液為接種體;選擇東鄉野生稻及兩優培九生育期處于劍葉與倒二葉葉枕距為(2±0.5)、(4±0.5)、(6±0.5)cm的稻穗于當日16:00～17:00進行接種。

1.3.2 不同接種體人工接種試驗 不同接種體的制備方法及其接種方法如下。

1.3.2.1 厚垣孢子 取上年使用UvB367接種后發病收集起來并在-20 ℃保存的稻曲球，放入馬鈴薯蔗糖液體(PS)培養基中,振蕩洗脫稻曲球表面的厚垣孢子,用紗布過濾掉雜質及稻曲球；取濾液在血球計數板下計數并將厚垣孢子濃度稀釋至1×106個/mL，備用。

1.3.2.2 菌絲片段-分生孢子混合液 將5～6粒UvB367菌塊從培養皿轉移至100 mL PS培養基中,以135 r/min在28 ℃條件下震蕩培養6～7 d,將所有搖瓶中的培養液混合后用組織搗碎機粉碎,取少量在血球計數板下計數并將培養液稀釋至分生孢子濃度為1×106個/mL。將稀釋后的培養液充分混勻并平均分為3份,第1份即為菌絲片段-分生孢子混合液接種體。

1.3.2.3 分生孢子懸浮液 取1.3.2.2中獲得的第2份稀釋培養液用4層滅菌紗布過濾,用少量無菌水沖洗紗布后將濾液收集并以8000 r/min離心[8],去上清留沉淀,隨后用PS將沉淀重懸浮至分生孢子濃度為1×106個/mL,備用。

1.3.2.4 菌絲片段 取1.3.2.2中獲得的第3份稀釋培養液用4層滅菌紗布過濾,用少量無菌水沖洗紗布后用滅菌鑷子將紗布上所有菌絲挑至PS培養基中,將培養基定容至與第3份培養液過濾前相同的體積,備用。

采用注射接種法于16:00～17:00將上述不同接種體接種至東鄉野生稻及兩優培九稻穗中。依據1.3.1中的試驗結果,東鄉野生稻與兩優培九分別選擇葉枕距為(4±0.5)cm及(6±0.5)cm的稻穗進行接種。

1.3.3 當日不同時間人工接種試驗 采用菌絲片段-分生孢子混合液于當日8:00～9:00、12:00～13:00和16:00～17:00分別進行接種,接種方法及接種水稻的生長時期同1.3.2。

以上3個試驗在東鄉野生稻A1～A9、B1～B9、C1～C9以及所有種植批次兩優培九1～8行中滿足相應條件的稻穗上進行。由于東鄉野生稻滿足接種條件的稻穗較少,因此每個處理東鄉野生稻接種3～5個穗,對照品種兩優培九接種10個穗。

1.3.4 不同接種方法的人工接種試驗 分別研究醫用注射器注射接種和噴霧器噴霧接種對東鄉野生稻稻曲病的接種效果。

1.3.4.1 注射接種 用規格為5 mL的醫用注射器將孢子濃度為1×106個/mL的菌絲片段-分生孢子混合液從水稻穗中上部位注射入穗苞中,每穗注射2 mL,不超過2 mL的以菌液從穗苞頂端流出為準；接種時間及接種水稻的生長時期同1.3.2。

1.3.4.2 噴霧接種 用SeeSa“SX-CS5F”型氣壓式噴霧器(工作壓力:3 hPa)將孢子濃度為1×106個/mL的菌絲片段-分生孢子懸浮液噴射到符合條件的稻穗上,噴射量以菌液在穗苞上聚成滴但又不滴下為準；接種時間及接種水稻的生長時期同1.3.2。

注射接種在東鄉野生稻A1～A9、B1～B9、C1～C9以及不同批次兩優培九1～8行中滿足相應條件的稻穗上進行,噴霧接種在東鄉野生稻A10、B10、C10以及不同批次兩優培九第10行中滿足相應條件的稻穗上進行。

1.4 試驗調查統計

于接種后10 d第一次調查接種水稻稻曲病的發病情況,之后每隔7 d調查一次,以水稻接近成熟時稻曲球不再增加為止。調查每個接種稻穗上稻曲球個數,統計各處理稻曲球平均數。

2 結果與分析

2.1 水稻生長時期對接種效果的影響

調查結果顯示,在東鄉野生稻DX13、DX35、DX67生長至劍葉與倒二葉葉枕距為(4±0.5)cm時接種,其稻曲球平均數明顯高于水稻劍葉與倒二葉葉枕距為(6±0.5)cm時接種;栽培稻兩優培九在生長至劍葉與倒二葉葉枕距為(6±0.5)cm時接種,其稻曲球平均數明顯高于劍葉與倒二葉葉枕距為(4±0.5)cm時接種(表1)。結果表明,東鄉野生稻與兩優培九的稻曲病接種最適時期并不一致(圖1)。東鄉野生稻DX13、DX35、DX67與栽培稻兩優培九在葉枕距為(2±0.5)cm時接種均未誘發稻曲病,表明孕穗初期接種不利于誘發稻曲病(表1);試驗發現此時接種還容易導致不抽穗或抽穗后稻粒空殼現象。

表1 水稻在不同生長時期接種后稻曲病的發病情況

圖1 在水稻不同生長時期接種后稻曲球平均數

2.2 接種體對接種效果的影響

調查結果(表2)顯示：以菌絲片段-分生孢子混合液為接種體接種東鄉野生稻DX13、DX35、DX67及兩優培九時,誘發稻曲病的效果最好；以菌絲片段和分生孢子懸浮液為接種體接種時誘發效果次之；以厚垣孢子接種未能誘發東鄉野生稻及兩優培九的稻曲病。結果表明,不同接種體接種對東鄉野生稻稻曲病的誘發效果不同,但對東鄉野生稻稻曲病的誘發效果趨勢與兩優培九保持一致(圖2)。

表2 不同接種體接種后稻曲病的發生情況

2.3 接種時間對接種效果的影響

調查結果顯示,于8:00～9:00、12:00～13:00和16:00～17:00三個時間段對東鄉野生稻DX13、DX35、DX67及兩優培九接種均可誘發稻曲病(表3),但病害嚴重度差異明顯,其中以16:00～17:00時接種的病情最為嚴重,其次為8:00～9:00時接種，而在12:00～13:00時接種的病情最輕(圖3)。結果表明,在一天中16:00～17:00接種最有利于東鄉野生稻稻曲病的發病,這與兩優培九的最佳接種時間段是一致的。

接種體A:厚垣孢子;接種體B:分生孢子懸浮液;接種體C:菌絲片段;接種體D:菌絲片段-分生孢子混合液。

圖2 不同接種體接種后稻曲球平均數表3 一天中不同時間接種后稻曲病的發生情況

圖3 一天中不同時間接種后稻曲球平均數

2.4 接種方法對人工接種效果的影響

調查結果(表4)顯示：注射接種可誘發東鄉野生稻DX13、DX35、DX67及兩優培九稻曲病的發生；噴霧接種未能誘發東鄉野生稻任何單株稻曲病的發生；噴霧接種可誘發兩優培九稻曲病的發生,但病情嚴重度明顯低于注射接種的水稻(圖4)。該結果表明,注射接種更有利于誘發東鄉野生稻稻曲病的發生。

3 總結與討論

本研究采用不同接種體、不同接種方法,在水稻不同生長時期,于一天中不同時間對3株東鄉野生稻單株進行稻曲病人工接種試驗,探索了東鄉野生稻稻曲病人工接種技術。結果表明,當水稻生長至劍葉與倒二葉間距為(4±0.5)cm時,以菌絲片段-分生孢子混合液作為接種體,采用注射的方法于一天中16：00～17：00時進行接種對東鄉野生稻誘發稻曲病效果最好。這一結果有助于指導東鄉野生稻的抗病性鑒定,篩選抗性群體及抗性個體,挖掘優異野生抗性種質。

表4 用不同方法接種后稻曲病的發生情況

圖4 用不同方法接種后稻曲球平均數

王疏等[9]、林瑜凡等[10]報道厚垣孢子可引起稻曲病的發生；王舒婷[11]則報道厚垣孢子未能引起稻曲病的發生。張君成等在2003年[12]報道了接種厚垣孢子的稻曲病發病率，但其病情指數均很低；2004年他卻又報道接種厚垣孢子沒有引起稻曲病的發病[8]。以上結果表明以厚垣孢子為接種體誘發水稻稻曲病的效果存在不穩定性。在本研究中，厚垣孢子同樣沒有引起東鄉野生稻與兩優培九的發病。相反,接種體菌絲片段-分生孢子對稻曲病有較好的誘發效果得到了較多學者[8,11,13-14]的認可,本研究也得到了類似的結果。因此,在東鄉野生稻稻曲病人工接種中建議以菌絲片段-分生孢子混合液作為接種體。

張君成等[8]報道在水稻兩優培九破口前6～9 d接種對稻曲病的誘發效果最好;代海霞等[13]報道水稻岡優305在破口前4 d接種時的稻曲病發病效果好于在破口前7 d接種時的發病效果,表明不同水稻品種稻曲病誘發的最佳時期與破口期的間距不同。據楊秀娟等[14]報道，兩優培九在孕穗期劍葉與倒二葉葉枕距為8～9 cm時接種誘發的稻曲球平均粒數高于在0～7 cm及10～13 cm時接種誘發的稻曲球平均粒數,這與賈切[15]的研究結果“水稻粵優938幼穗在劍葉與倒二葉葉枕距16～17 cm時接種誘發的稻曲病病穗率顯著高于在0～10 cm時接種誘發的稻曲病病穗率”不同,表明不同水稻品種處于稻曲病最佳誘發時期時劍葉與倒二葉葉枕距也不相同。本研究中東鄉野生稻與栽培稻兩優培九處于稻曲病最佳誘發時期時劍葉與倒二葉葉枕距的不同也進一步證實了該結論。因此,在進行多個水稻品種抗稻曲病人工鑒定時,以固定的稻穗破口前某一天或者統一的劍葉與倒二葉葉枕距進行接種雖然接種條件一致,但反而會導致結果存在一定的誤差,建議對篩選出來的抗性材料在多個生長時期下接種以進行進一步的驗證,這樣得到的抗性鑒定結果會更加可靠。