RBL-2H3細(xì)胞不適合用于類過(guò)敏模型的建立

張小雨，齊睿娟，李西蒙，韓宜芯，費(fèi)巧玲，蔡潤(rùn)蘭，齊 云，高 源

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

近十余年，速發(fā)型超敏反應(yīng)性疾病的患病率迅速增高，已成為當(dāng)今社會(huì)的流行病，這與環(huán)境因素和生活方式的改變有關(guān)。速發(fā)型超敏反應(yīng)主要分為免疫介導(dǎo)型和非免疫介導(dǎo)型兩大類。免疫介導(dǎo)型中最為常見的是由IgE-FcεRI介導(dǎo)的I型速發(fā)型超敏反應(yīng)，也就是常說(shuō)的過(guò)敏反應(yīng)。其發(fā)生是由于過(guò)敏原初次進(jìn)入機(jī)體誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，抗體以Fc段與靶細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)同一過(guò)敏原再次進(jìn)入機(jī)體，與致敏靶細(xì)胞表面IgE抗體結(jié)合，使FcεRI交聯(lián)活化，誘導(dǎo)靶細(xì)胞脫顆粒，釋放活性介質(zhì)。而非免疫型超敏反應(yīng)，國(guó)內(nèi)學(xué)者常稱之為類過(guò)敏反應(yīng)，其誘發(fā)機(jī)制主要有兩類：一是通過(guò)直接方式刺激效應(yīng)細(xì)胞(主要是肥大細(xì)胞)，例如基礎(chǔ)分泌素(P物質(zhì)、Compound 48/80和黃蜂毒素等)可直接結(jié)合肥大細(xì)胞表面的Mas相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體(Mas-related G protein coupled receptor，Mrgpr)，致使細(xì)胞活化引起脫顆粒，同時(shí)釋放生物活性介質(zhì)[1]；二是通過(guò)間接的方式刺激肥大細(xì)胞釋放生物活性介質(zhì)，如雙黃連注射劑可通過(guò)活化補(bǔ)體毒素C5最終引起速發(fā)型超敏反應(yīng)[2]。

大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞(RBL-2H3)因易在培養(yǎng)基中大量生長(zhǎng)，對(duì)IgE-FcεRI介導(dǎo)的信號(hào)反應(yīng)好，且基因能被改造，廣泛被用于IgE-FcεRI介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒模型研究[3]，但對(duì)直接刺激引起的脫顆粒響應(yīng)情況并不十分清楚。國(guó)外有研究報(bào)道稱RBL-2H3細(xì)胞對(duì)Compound 48/80沒有應(yīng)答[4]，但國(guó)內(nèi)使用Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞作為類過(guò)敏模型或用Compound 48/80作為陽(yáng)性藥評(píng)價(jià)中藥注射液致RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒情況的現(xiàn)象卻相當(dāng)普遍[5]。

肥大細(xì)胞脫顆粒釋放出活性介質(zhì)，包括組胺、β-己糖胺酶、類蛋白酶等，其中，β-己糖胺酶測(cè)定方法穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)單便捷，因此常作為評(píng)價(jià)脫顆粒程度的重要指標(biāo)之一。由于目前理想的肥大細(xì)胞株難以通過(guò)商業(yè)化途徑獲得，而嗜堿性粒細(xì)胞因在IgE-FcεRI介導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)上響應(yīng)度與肥大細(xì)胞相當(dāng)而被廣泛使用[6]。但在類過(guò)敏反應(yīng)模型上，嗜堿性粒細(xì)胞是否也能像在免疫介導(dǎo)型反應(yīng)上替代肥大細(xì)胞還沒有明確的結(jié)論。本文通過(guò)考察RBL-2H3細(xì)胞上MrgprB2受體的表達(dá)情況，測(cè)定不同濃度Compound 48/80對(duì)RBL-2H3細(xì)胞活力和β-己糖胺酶釋放量的作用，以及對(duì)比RBL-2H3細(xì)胞、人肥大細(xì)胞系LAD2和大鼠腹腔肥大細(xì)胞(Rat peritoneal mast cells，RPMCs)對(duì)Compound 48/80的響應(yīng)性的差異來(lái)全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)RBL-2H3細(xì)胞是否適用于建立類過(guò)敏反應(yīng)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 RBL-2H3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。RPMCs從SD大鼠中提取分離。人肥大細(xì)胞系LAD2 (Michael D. Gershon, MD, Columbia University, USA)受贈(zèng)于孫仁山教授(第三軍醫(yī)大學(xué)，重慶，中國(guó))。

1.1.2動(dòng)物 SPF級(jí)成年♂SD大鼠1只，體質(zhì)量220 g；SPF級(jí)成年♂BALB/c小鼠10只，體質(zhì)量(18～20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，正常飲食，循環(huán)光照。

1.1.3試劑 鋁佐劑、胰酶和DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：2004655)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide(批號(hào)：BCBX5480)和Compound 48/80(批號(hào)：102M4086V)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl 5-(3-carb oxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS，批號(hào)：0000177650)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；吩嗪硫酸二甲酯(PMS，批號(hào)：11607085)購(gòu)自美國(guó)Honeywell公司；TRIzol試劑和M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(批號(hào)：B532435-0010)均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；StarLighter SYBR Green qPCR Mix購(gòu)自北京啟衡星生物科技有限公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)試劑。

1.1.4儀器 恒溫金屬浴(北京金銀杏生物科技有限公司，H2O3-PRO型)，低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司，2-16PK型)，Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Electron公司，Type354型)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，F(xiàn)D-1B-50型)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)系統(tǒng)儀(杭州博日科技有限公司，F(xiàn)QD-96A型)，紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，NANODROP 2000型)，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，Dy89-Ⅱ型)，倒置顯微鏡(重慶廣電儀器公司，XDS-1B型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蝦總蛋白(shrimp total protein, ST)的提取和純化 按Capobianco等[7]利用等電點(diǎn)沉淀為原理的方法，從刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis)提取并純化得ST。

1.2.2抗ST血清的制備 按照本課題組之前建立的方法[8]制備抗血清。

1.2.3大鼠腹腔肥大細(xì)胞的提取 異氟烷麻醉健康大鼠，股動(dòng)脈放血致死。腹腔注射20 mL預(yù)冷的Hank’s平衡緩沖鹽溶液，輕柔按摩腹部3 min后，剪開腹部皮膚，沿腹白線剖開腹部，將腹腔內(nèi)容物推向一側(cè)，以滴管將腹腔液收集于離心管中，放入冰浴內(nèi)冷卻，600×g離心10 min，棄上清得肥大細(xì)胞沉淀物，用Hank’s平衡緩沖鹽溶液重懸得肥大細(xì)胞混懸液。

1.2.4β-己糖胺酶的測(cè)定 對(duì)于免疫介導(dǎo)的脫顆粒研究，將RBL-2H3按2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的抗ST血清敏化過(guò)夜。次日，用Hank’s平衡緩沖鹽溶液沖洗細(xì)胞一次，加入20 μg·L-1的ST孵育1.5 h。

對(duì)于非免疫介導(dǎo)途徑的脫顆粒研究，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(RBL-2H3為2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔；LAD2為1.6×104個(gè)細(xì)胞/孔；RPMCs為6.7×104個(gè)細(xì)胞/孔)。實(shí)驗(yàn)孔給予不同濃度的Compound 48/80(終濃度為5、10、20、40、80 mg·L-1，DMEM培養(yǎng)基配制)，空白對(duì)照孔加入等體積的DMEM培養(yǎng)基。置培養(yǎng)箱中37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)1.5 h。

1.5 h后，取上清20 μL加入96孔全黑酶標(biāo)板，加入0.57 g·L-1β-己糖胺酶底物4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide(枸櫞酸鈉緩沖液配置，133 mmol·L-1枸櫞酸鈉，133 mmol·L-1氯化鈉，調(diào)至pH4.3)50 μL，25 ℃避光反應(yīng)2 h，加入180 μL終止液(50 mmol·L-1甘氨酸，5 mmol·L-1EDTA-Na2，調(diào)至pH10.5)終止反應(yīng)，于Ex: 355 nm，Em: 460 nm處測(cè)定其熒光值。

1.2.5總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照說(shuō)明書方案用Trizol試劑提取總 RNA。用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用SYBR qPCR kit試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，循環(huán)條件為： 95 ℃(20 s)，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)的95 ℃(15 s)和62 ℃(20 s)。我們考察了RBL-2H3細(xì)胞的β-actin和MrgprB2的mRNA水平，引物序列為： β-actin的正引物為5′-TACAACTCCTTGCAGCTCC-3′，反引物為5′-ATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3′。MrgprB2的正引物為5′-AGCGGATACTGACCAGACTG-3′，反引物為5′-CCATTGGATGAGCCAGGAGATTCC-3′。

1.2.6細(xì)胞活力測(cè)定 采用MTS方法測(cè)定細(xì)胞活力。在Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞1.5 h之后棄去上清，用預(yù)溫的DMEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次，加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，按MTS(2 g·L-1)與PMS(0.92 g·L-1)20 ∶1的比例配置MTS混合溶液，每孔20 μL ，37 ℃孵育2 h，于492 nm測(cè)定OD值。

2 結(jié)果

2.1 RBL-2H3細(xì)胞對(duì)IgE-FcεRI信號(hào)通路響應(yīng)靈敏如Fig 1所示，與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)給予終濃度為1%的ST抗血清或ST(20 μg·L-1)時(shí)，RBL-2H3細(xì)胞釋放β-己糖胺酶水平?jīng)]有顯著變化；而用1%的ST抗血清致敏后的RBL-2H3細(xì)胞再受到ST(20 μg·L-1)攻擊后發(fā)生脫顆粒，細(xì)胞上清中β-己糖胺酶水平顯著升高，是空白對(duì)照組的13.24倍(P<0.01)。

Fig 1 RBL-2H3 cell degranulation

**P<0.01vscontrol.

2.2 RBL-2H3細(xì)胞可表達(dá)MrgprB2受體通過(guò)RT-qPCR考察了RBL-2H3細(xì)胞的內(nèi)參基因β-actin和目標(biāo)基因MrgprB2的mRNA的表達(dá)水平。循環(huán)閾值(CT值，Cycle threshold)為樣品的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。擴(kuò)增結(jié)果顯示(Fig 2A、B)，在RBL-2H3細(xì)胞中，內(nèi)參基因β-actin的 CT值為11.38，目標(biāo)基因MrgprB2的CT值為26.84，表明RBL-2H3細(xì)胞上有MrgprB2受體表達(dá)。

Fig 2 Expression of MrgprB2 receptor in

A: The amplification curve of reference gene β-actin and target gene MrgprB2 in RBL-2H3 cells assayed by RT-qPCR; B: The cycle threshold of β-actin and MrgprB2 in RBL-2H3 cells.

2.3 基礎(chǔ)分泌素Compound 48/80能劑量依賴性地誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞釋放β-己糖胺酶除了IgE-FcεRI介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞經(jīng)典脫顆粒途徑外，基礎(chǔ)分泌素還可以通過(guò)與MrgprB2受體結(jié)合直接誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒。我們測(cè)定了最常用的基礎(chǔ)分泌素Compound 48/80在不同劑量下對(duì)RBL-2H3細(xì)胞釋放β-己糖胺酶的作用。如Fig 3所示，當(dāng)Compound 48/80劑量達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，即可顯著誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞釋放β-己糖胺酶，且隨著Compound 48/80劑量升高，β-己糖胺酶釋放量也相應(yīng)升高。但總體來(lái)說(shuō)，RBL-2H3細(xì)胞對(duì)Compound 48/80并不敏感，劑量高至80 mg·L-1時(shí)，釋放率也僅為空白對(duì)照組的3.47倍。

Fig 3 Relative level of β-hexosaminidase released from RBL-2H3 induced by different concentrations of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.4 基礎(chǔ)分泌素Compound 48/80在高劑量時(shí)促RBL-2H3細(xì)胞釋放β-己糖胺酶是由于其細(xì)胞毒作用我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡(×200)下觀察了不同劑量的Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞1.5 h后細(xì)胞的形態(tài)(Fig 4A)，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞呈梭形，形態(tài)完整，邊緣光滑，立體感強(qiáng)，有光澤。Compound 48/80達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞開始腫脹變形，表面出現(xiàn)大小不均的顆粒狀物質(zhì)，但細(xì)胞形態(tài)仍然完整。當(dāng)Compound 48/80增加到40 mg·L-1時(shí)，可明顯觀察到細(xì)胞形態(tài)開始不完整，無(wú)光澤，釋放出大量顆粒物質(zhì)。而80 mg·L-1Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞1.5 h則導(dǎo)致RBL-2H3細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重破壞，在視野范圍內(nèi)可觀察到大量的細(xì)胞碎片。我們又用MTS法測(cè)定了不同劑量的Compound 48/80對(duì)RBL-2H3細(xì)胞活力的影響(Fig 4B)。結(jié)果顯示，20 mg·L-1Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞1.5 h存活率為82.1%，已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞活力的抑制趨勢(shì)(盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。而40 mg·L-1及其以上劑量Compound 48/80對(duì) RBL-2H3細(xì)胞存活率有顯著影響(P<0.05)，40 mg·L-1和80 mg·L-1Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞存活率分別為73.0%和63.4%，與光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果一致，說(shuō)明40 mg·L-1及以上的Compound 48/80對(duì)RBL-2H3細(xì)胞會(huì)造成顯著毒性。隨之，我們同時(shí)測(cè)定了與測(cè)MTS同孔細(xì)胞上清中β-己糖胺酶水平，結(jié)果顯示(Fig 4C)，在Compound 48/80劑量≥ 10 mg·L-1時(shí)，即可顯著促進(jìn)細(xì)胞釋放β-己糖胺酶(P<0.05)，且呈劑量依賴關(guān)系。但結(jié)合MTS的結(jié)果(Fig 4B)可知，在20 mg·L-1以上劑量時(shí)所出現(xiàn)的致脫顆粒作用，已經(jīng)不能完全歸咎于Compound 48/80與膜表面的Mrgpr受體的特異性反應(yīng)。

Fig 4 Cytotoxicity of different concentrations of Compound 48/80 on RBL-2H3 cells n=3)

A: The morphology of RBL-2H3 cells induced by different concentrations of Compound 48/80 (×200); B: Effect of Compound 48/80 on the viability of RBL-2H3 cells; C: The level of β-hexosaminidase released from RBL-2H3 induced by Compound 48/80 at the indicated concentrations.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.5 RBL-2H3細(xì)胞不適用于類過(guò)敏模型的建立我們選用確定的無(wú)毒劑量10 mg·L-1Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞、LAD2細(xì)胞和RPMCs細(xì)胞，1.5 h后，測(cè)定3種細(xì)胞上清中β-己糖胺酶水平。結(jié)果表明 (Fig 5)，10 mg·L-1Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞的β-己糖胺酶釋放量只有空白對(duì)照組的2.35倍，而同樣劑量的Compound 48/80刺激LAD2和RPMCs的β-己糖胺酶釋放量分別為空白對(duì)照組的15.02倍和16.05倍，說(shuō)明RBL-2H3細(xì)胞對(duì)Compound 48/80的響應(yīng)性遠(yuǎn)不如LAD2或RPMCs強(qiáng)。

3 討論

RBL-2H3細(xì)胞是Eccleston團(tuán)隊(duì)1973年在一只用致癌物處理過(guò)的大鼠中獲得的RBL-1細(xì)胞經(jīng)單克隆分離出來(lái)的亞系，被稱為大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞[9]。因其生長(zhǎng)迅速、可操作性強(qiáng)、存活率高、同質(zhì)性好等優(yōu)點(diǎn)近年來(lái)被廣泛研究。RBL-2H3細(xì)胞具有肥大細(xì)胞的一些特性，如表面表達(dá)有IgE的高親和力受體FcεRI，在IgE激活時(shí)脫顆粒，因而常被用于IgE與FcεRI結(jié)合后下游通路的機(jī)制研究。除此之外，還用于建立IgE-FcεRI介導(dǎo)的脫顆粒模型[10]。但是有學(xué)者認(rèn)為RBL-2H3細(xì)胞不能用于建立一個(gè)準(zhǔn)確的肥大細(xì)胞介質(zhì)釋放的模型，RBL-2H3細(xì)胞與肥大細(xì)胞之間仍存在諸多差異，比如RBL-2H3細(xì)胞對(duì)基礎(chǔ)分泌素沒有響應(yīng)；盡管表面表達(dá)TLR4受體但LPS無(wú)法激活該細(xì)胞；肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑酮替芬和色甘酸二鈉并不能在RBL-2H3細(xì)胞上表現(xiàn)出細(xì)胞膜穩(wěn)定效果等[11]。

本研究結(jié)果表明，RBL-2H3細(xì)胞對(duì)IgE-FcεRI信號(hào)通路響應(yīng)非常靈敏(Fig 1)，與之相比，其對(duì)Compound 48/80的反應(yīng)性卻相當(dāng)差(Fig 3)，這與Senyshyn等[4]報(bào)道RBL-2H3細(xì)胞可能由于缺乏G蛋白偶聯(lián)受體的亞蛋白Gi-3而對(duì)基礎(chǔ)分泌素Compound 48/80沒有應(yīng)答結(jié)論一致，因?yàn)镃ompound 48/80是通過(guò)激活肥大細(xì)胞細(xì)胞膜上Mrgpr受體家族向下游傳導(dǎo)信號(hào)引起脫顆粒的。

有學(xué)者通過(guò)生物信息學(xué)分析，在小鼠、大鼠和人類中鑒定出大約50個(gè)Mrgpr基因：MrgprA，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H和一個(gè)人類特有的MrgprX。有趣的是，不同的亞科由不同物種中的多個(gè)重復(fù)基因組成。人類有多個(gè)MrgprX基因，而嚙齒類動(dòng)物有多個(gè)MrgprA、B和C基因，甚至不同的嚙齒動(dòng)物物種每個(gè)亞科的基因數(shù)量也不同[12]。肥大細(xì)胞表面Mrgpr受體家族間存在著巨大的物種特異性。2015年McNeil等[5]首次證實(shí)MrgprX2受體是在人肥大細(xì)胞上能夠被基礎(chǔ)分泌素特異性觸發(fā)類過(guò)敏反應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體，配體主要包括P物質(zhì)、黃蜂毒素、Compound 48/80等[1]。而在大鼠中，腹腔肥大細(xì)胞表面可以檢測(cè)到MrgprB1、B2、 B3、 B6、 B8和B9的表達(dá)，但沒有MrgprA和MrgprC表達(dá)[12]。根據(jù)RBL-2H3細(xì)胞對(duì)基礎(chǔ)分泌素Compound 48/80的響應(yīng)性不佳的特點(diǎn)(Fig 3)，我們最初推測(cè)RBL-2H3細(xì)胞根本不表達(dá)或幾乎不表達(dá)Mrgpr受體家族相關(guān)基因。但是RT-qPCR結(jié)果卻顯示(Fig 2)，RBL-2H3細(xì)胞是有MrgprB2基因表達(dá)的。而無(wú)論是同為大鼠來(lái)源的RPMCs，還是人肥大細(xì)胞株LAD2，均對(duì)安全劑量的Compound 48/80響應(yīng)性良好(Fig 5)。這些結(jié)果提示嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞可能在Mrgpr受體家族的表達(dá)量上存在較大差異，RBL-2H3對(duì)除Compound 48/80之外的基礎(chǔ)分泌素響應(yīng)性也不佳可能也與之相關(guān)[13]，并且，有研究報(bào)道RBL-2H3細(xì)胞上不表達(dá)補(bǔ)體的受體，對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的非免疫型超敏反應(yīng)也沒有響應(yīng)[14]，故RBL-2H3細(xì)胞并不適合用于類過(guò)敏模型的建立。

**P<0.01vscontrol.

我們也發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)有不少學(xué)者用Compound 48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞作為類過(guò)敏模型[15]，或在評(píng)價(jià)中藥注射劑類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)將Compound 48/80作為陽(yáng)性藥使用[5]。但這些研究中Compound 48/80使用劑量普遍偏大，甚至超過(guò)了安全劑量，因此不能排除因Compound 48/80劑量過(guò)大導(dǎo)致細(xì)胞破裂的原因，而非基礎(chǔ)分泌素與Mrgpr受體之間的特異性反應(yīng)而致脫顆粒。同理，在注射劑過(guò)敏性評(píng)價(jià)時(shí)，可能也存在著由于注射劑劑量超過(guò)安全劑量引起的“假脫顆粒”現(xiàn)象。

在本研究中，我們通過(guò)三種細(xì)胞對(duì)于基礎(chǔ)分泌素Compound 48/80響應(yīng)性的對(duì)比 (Fig 5)，發(fā)現(xiàn)安全無(wú)毒劑量Compound 48/80(10 mg·L-1)刺激RBL-2H3細(xì)胞的β-己糖胺酶釋放量?jī)H為空白對(duì)照組的2.35倍，而在同樣條件下的LAD2和RPMCs的β-己糖胺酶釋放量分別為空白對(duì)照組的15.02倍和16.05倍(Fig 5)。其實(shí)早在2009年，已經(jīng)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RBL-2H3細(xì)胞只適合研究IgE介導(dǎo)的脫顆粒，而認(rèn)為它在其它方面并不具有代表性[10]。盡管當(dāng)時(shí)Mrgpr作為基礎(chǔ)分泌素受體的功能屬性尚未被發(fā)現(xiàn)，但RBL-2H3細(xì)胞與真正的肥大細(xì)胞的區(qū)別卻早就被認(rèn)知，今天我們的研究結(jié)果也只是豐富了這個(gè)結(jié)論。