一株分離于含水層介質的好氧反硝化菌脫氮性能研究*

朱曉明 趙東華 阮曉紅

(1.中交上海航道勘察設計研究院有限公司，上海 200120；2.南京大學地球科學與工程學院，江蘇 南京 210093)

近年來，由于經濟社會快速發展，工農業生產活動所產生的污廢水排放量顯著增加，全球范圍內出現了不同程度的水體氮污染問題，如何有效脫氮成為水污染防治領域的一個熱點和難點問題[1],[2]523,[3]。生物脫氮相比物理或化學脫氮方法是比較高效、經濟的污水脫氮方法[4]4242,[5]。傳統生物脫氮理論認為，反硝化只能在無氧或厭氧條件下進行[2]523，但近年好氧反硝化菌被不斷報道，在河道[6]、湖泊[2]523,[7]、水庫[8]5508、海洋[9-10]、土壤[11]、水田[12]998、濕地[13]1314等自然環境和活性污泥或生物膜反應器[14-16]、焦化廢水[17]、石化污水[18]、垃圾滲濾液[19-20]、養殖廢水[21]等人工環境中均有發現，包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、副球菌屬(Paracoccus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、根瘤菌屬(Rhizobium)、無色桿菌屬(Achrobacter)和不動桿菌屬(Acinetobacter)等，但淺層地下水含水層介質中的好氧反硝化菌分離和脫氮性能研究還鮮有報道。

淺層地下水極易受含氮污染物污染。已有研究發現，太湖流域多地淺層地下水存在不同程度的“三氮”污染問題[22-24]。好氧反硝化菌生長快速、適應性強、脫氮效率高[12]997，含水層介質中好氧反硝化菌的發現可為淺層地下水氮污染修復提供一種可能途徑。

本研究在蘇州某一受氮污染的淺層地下水含水層介質中分離、純化得到一株好氧反硝化菌，從形態、生理生化和分子生物學等方面鑒定了該菌株，并研究了其好氧反硝化脫氮性能、生長過程及脫氮動力學，考察了脫氮性能的影響因素，為好氧反硝化菌在淺層地下水氮污染修復工程中的實際工程應用奠定基礎。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

菌株分離樣品采自蘇州某一受氮污染的淺層地下水含水層介質，位于地表以下6.5 m處，土壤為粉質黏土，現場采集樣品后用無菌采樣管密封保存，4 ℃條件下運回實驗室。

富集培養基：KNO3，2.0 g；檸檬酸三鈉，5.0 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；KH2PO4，1.0 g；去離子水，1 L；微量元素溶液，2 mL；pH調為7.0～7.5。其中，微量元素溶液：乙二胺四乙酸二鈉，57.1 g/L；ZnSO4，2.2 g/L；CaCl2，5.3 g/L；MnCl2，3.2 g/L；FeSO4，2.7 g/L；(NH4)6Mo7O24，1.0 g/L；CuSO4，1.0 g/L；CoCl2，0.9 g/L；pH 為7.0。

反硝化液體培養基：KNO3，0.72 g/L；其余同富集培養基。反硝化固體培養基另需加入2%(質量分數)瓊脂。

1.2 主要儀器

SG6型便攜式DO儀、PHPJ-260型便攜式pH計、IL550型總有機碳(TOC)分析儀、UV2100型紫外/可見分光光度計、ZWF-1112型立式雙層大容量恒溫振蕩器、D-37520型離心機、ALD1244型電泳儀、QuantStudio 3型實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀。

溫度、DO由DO儀測定，pH、氧化還原電位(ORP)由pH計測定，硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、總氮分別采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)乙二胺分光光度法、過硫酸鉀氧化—紫外分光光度法測定，溶解性有機碳(DOC)經離心過濾后由TOC分析儀測定，波長600 nm處吸光度(OD600)用紫外/可見分光光度計測定。

2 實驗研究方法

2.1 菌株的分離和鑒定

2.1.1 菌株分離、純化和篩選

取10 g新鮮菌株分離樣品接種于90 mL滅菌富集培養基上，28 ℃下培養3 d，然后取菌液5 mL接種于新的富集培養基上再培養3 d，重復富集3次。取1 mL富集后菌液涂于反硝化固體培養基平板上，培養3 d后將不同形態的菌落進行分離，多次分離后，將純化的菌株接種于裝有5 mL反硝化液體培養基的試管中，37 ℃下在180 r/min的恒溫振蕩器上振蕩培養3 d，吸取少量菌液，滴加格里斯試劑、二苯胺試劑和奈氏試劑篩選好氧反硝化菌，記為菌株PJ21。

2.1.2 菌株形態和生理生化鑒定

將菌株PJ21在反硝化固體培養基上劃線培養，長出單菌落后進行形態觀察和生理生化特性測試[25]。

2.1.3 分子生物學鑒定

利用DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit DP302)提取菌株PJ21的16S rDNA并進行擴增。采用細菌通用正向引物(27F)和反向引物(1492R)進行擴增[8]5508，構建50 μL反應體系：模板DNA 1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(0.2 mmol/L)4 μL，引物(0.5 μmol/L)各2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl2(2 mmol/L) 3 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.25 μL，超純水32.75 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，然后進入熱循環(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環)。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用The QuickClean Ⅱ膠回收試劑盒純化，然后將PCR產物連接到TA載體進行克隆，委托深圳華大基因科技有限公司測序，輸入GenBank數據庫(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast細菌基因序列同源性比對，用MEGA軟件中Kimura-Parameter Distance模型計算進化距離，采用 Neighbor-Joining構建系統發育樹。

2.2 脫氮性能及其影響因素研究

2.2.1 脫氮性能初探

將菌株PJ21接種于反硝化液體培養基，28 ℃、120 r/min條件下培養1 d制得種子液，將種子液以1%(體積分數)接種量接入新的反硝化液體培養基，在好氧(DO=6.9～7.8 mg/L)，初始硝酸鹽氮(用KNO3配制，下同)也即總氮質量濃度276.95 mg/L，DOC(用檸檬酸三鈉配制，作碳源)質量濃度1 400 mg/L，28 ℃、120 r/min條件下培養60 h，每隔一定時間取樣檢測總氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、DOC及OD600。

脫氮率或DOC利用率(η，%)和脫氮速率(R，mg/(L·h))分別按式(1)和式(2)計算[26]。

η=(C1-C2) /C1×100%

(1)

R=(C1-C2) / (t2-t1)

(2)

式中：C1、C2分別為t1、t2時刻的氮或DOC質量濃度，mg/L。

2.2.2 影響因素研究

在2.2.1節的基本條件下探索了碳源類型、溫度、初始pH 3個因素對菌株PJ21好氧反硝化性能的影響。碳源類型考察了琥珀酸鈉、檸檬酸三鈉、蘋果酸鈉、葡萄糖和蔗糖(初始硝酸鹽氮50.00 mg/L，DOC與總氮質量比(C/N)為10，pH=7.5)；溫度考察了10、20、25、30、35、40 ℃(初始硝酸鹽氮50.00 mg/L，C/N=10，pH=7.5)；初始pH考察了4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(初始硝酸鹽氮50.00 mg/L，C/N=10)。影響因素研究時培養24 h，測定OD600、DOC、硝酸鹽氮變化。

2.3 菌株生長及脫氮動力學研究

2.3.1 生長動力學

根據Monod方程研究微生物生長動力學[27]437,[28]16，計算菌株PJ21的最大比生長速率和Monod生長半飽和系數。

2.3.2 衰亡動力學

衰亡過程采用一級動力學方程(見式(3))來計算。

r1=K1X

(3)

式中：r1為微生物衰亡速率，mg/(L·s)；K1為衰亡速率系數，s-1；X為微生物質量濃度，mg/L，數值上通過480倍OD600估算得到。

2.3.3 硝酸鹽氮降解動力學

在Monod方程中引入產率系數可得到硝酸鹽氮降解速率方程并解得相關參數[27]438,[28]18。

3 結果與討論

3.1 菌株鑒定結果

菌株PJ21的菌落形態如圖1所示，菌落呈直徑1～3 mm的圓形，表面光滑，球形隆起，波狀邊緣，顏色為淡黃色，半透明。

菌株PJ21的生理生化特性如表1所示。采用半固體穿刺法對該菌株進行需氧性和運動性測定發現，菌株能夠沿著穿刺線穿透培養基擴散生長，說明菌株能夠在好氧和缺厭氧條件下兼性生長、運動。

圖1 菌株PJ21的菌落形態Fig.1 Morphological characteristics of bacterial colony of strain PJ21

表1 菌株PJ21的生理生化特性

分子生物學鑒定結果表明，菌株PJ21與多株假單胞菌屬的門多薩菌(Pseudomonasmendocina)同源性達99%，可確定菌株PJ21為假單胞菌屬的門多薩菌。

3.2 菌株好氧反硝化脫氮性能

由圖2可知，硝酸鹽氮在0～18 h迅速下降，尤其在0～6 h時，硝酸鹽氮從276.95 mg/L降至109.05 mg/L，12～24 h時降速減緩，24～60 h時下降很慢，幾乎不再下降，60 h時硝酸鹽氮質量濃度為12.32 mg/L。總氮在0～18 h內變化規律和硝酸鹽氮相似，18 h后基本趨于穩定。從氮的質量平衡分析，說明在通過好氧反硝化過程脫除氮的同時，也有部分硝酸鹽氮轉化為了菌體生長的內源氮。整個實驗過程中亞硝酸鹽氮質量濃度很低，為0.23～0.34mg/L，沒有出現明顯的亞硝酸鹽氮累積現象。

圖2 氮質量濃度變化Fig.2 Variation of nitrogen mass concentrations

由圖3可知，0～6、0～12、0～18、0～24 h的硝酸鹽氮脫氮率分別為60.62%、75.86%、87.11%、91.18%，DOC利用率分別為40.29%、55.68%、78.34%、88.67%；由圖4可知，0～6、6～12、12～18、18～24 h的硝酸鹽氮脫氮速率分別為27.98、7.03、5.19、1.88 mg/(L·h)。24 h后脫氮率、DOC利用率和脫氮速率都趨于穩定。培養結束(60 h)時，硝酸鹽氮脫氮率為95.55%，總氮脫氮率為65.42%；整個過程硝酸鹽氮的平均脫氮速率為4.41 mg/(L·h)，高于王秀杰等[4]4249報道的4.08 mg/(L·h)，黃廷林等[8]5509報道的0.06～0.07 mg/(L·h)，冶青等[12]1001報道的1.05 mg/(L·h)。

圖3 脫氮率和DOC利用率Fig.3 Efficiencies of nitrogen removal and DOC utilization

圖4 硝酸鹽氮脫氮速率Fig.4 Denitrification rates of nitrate nitrogen

3.3 脫氮性能影響因素探究

3.3.1 碳源類型的影響

如圖5所示，菌株PJ21在以檸檬酸三鈉、琥珀酸鈉、蘋果酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源時均能生長，但存在明顯差異。以檸檬酸三鈉為碳源時，菌株PJ21的硝酸鹽氮脫氮率、DOC利用率最高，分別為81.24%、60.31%；其次是以葡萄糖為碳源時，硝酸鹽氮脫氮率、DOC利用率分別為20.86%、32.09%；琥珀酸鈉、蔗糖和蘋果酸鈉為碳源時，硝酸鹽氮脫氮率、DOC利用率較低。可見，菌株PJ21的最佳碳源為檸檬酸三鈉。

圖5 碳源類型對菌株PJ21的影響Fig.5 Effect of carbon sources on strain PJ21

3.3.2 溫度的影響

溫度通過影響微生物體內酶活性從而影響脫氮效率[12]999。由圖6可見，不同溫度下菌株PJ21的生長和硝酸鹽氮脫氮率具有明顯差異，10～30 ℃時隨著溫度上升脫氮率和OD600升高；而30～40 ℃時隨著溫度上升脫氮率和OD600下降。菌株PJ21生長的適宜溫度為25～35 ℃，最適溫度為30 ℃。

圖6 溫度對菌株PJ21的影響Fig.6 Effect of temperature on strain PJ21

3.3.3 初始pH的影響

由圖7可知，不同初始pH條件下菌株PJ21的生長和硝酸鹽氮脫氮率存在顯著差異。當初始pH為4.0～7.0時，隨著初始pH增大脫氮率和OD600增加；而當初始pH為7.0～9.0時，隨著初始pH增大脫氮率和OD600下降。菌株PJ21生長較適宜的初始pH為6.0～8.0，最適初始pH為7.0，與陳玲等[13]1319報道的假單胞菌屬適宜初始pH相近。

3.4 菌株PJ21的生長及其脫氮動力學參數計算結果

由圖8(a)的OD600和DOC變化曲線可知，菌株

圖7 初始pH對菌株PJ21的影響Fig.7 Effect of initial pH on strain PJ21

圖8 菌株PJ21生長過程分析Fig.8 Process of growth analysis of strain PJ21

PJ21的生長遲緩期很短，很快速進入了對數增長期，生長穩定期也較短，而衰亡期較長。由圖8(b)可知，反硝化液體培養基的pH和ORP在遲緩期和衰亡期內變化很小，而在對數增長期和生長穩定期內發生顯著變化。

菌株PJ21的最大比生長速率和Monod生長半飽和系數分別為4.30×10-4s-1、142.99 mg/L。衰亡速率系數為7.90×10-5s-1(R2=0.991，說明適合采用一級動力學方程擬合)。硝酸鹽氮降解過程的產率系數為1.26。

4 結 論

(1) 從受氮污染的淺層地下水含水層介質中分離、純化得到一株好氧反硝化細菌PJ21，經形態、生理生化及分子生物學鑒定確定其為假單胞菌屬門多薩菌。

(2) 菌株PJ21具有高效好氧反硝化能力，能夠在短時間內實現快速反硝化脫氮，培養60 h后總氮、硝酸鹽氮脫氮率分別可達65.42%、95.55%，最大硝酸鹽氮脫氮速率可達27.98 mg/(L·h)，平均脫氮速率為4.41 mg/(L·h)，且不會有明顯的亞硝酸鹽氮累積現象。

(3) 菌株PJ21的最佳碳源為檸檬酸三鈉；適宜生長溫度為25～35 ℃，最適溫度為30 ℃；適宜生長的初始pH為6.0～8.0，最佳為7.0。

(4) 菌株PJ21生長遲緩期和穩定期均較短，能夠快速進入對數增長期，但衰亡期較長；最大比生長速率和Monod生長半飽和系數分別為4.30×10-4s-1、142.99 mg/L，衰亡速率系數為7.90×10-5s-1，硝酸鹽氮降解過程的產率系數為1.26。