磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎/仔魚的毒性效應*

2020-03-20 08:44:50劉仁彬姜錦林張宇峰單正軍

環境污染與防治 2020年3期

劉仁彬姜錦林張宇峰單正軍

(1.南京工業大學環境學院，江蘇南京 210009；2.國家環境保護農藥環境評價與污染控制重點實驗室，生態環境部南京環境科學研究所，江蘇南京 210042)

近年來，藥物在水環境中的殘留及持久性引起人們廣泛關注[1]，[2]1582。抗生素類是一種使用較廣泛的藥物，在人類健康及畜牧業發展方面發揮了巨大的作用[3]。我國是世界上抗生素產量及消費量最大的國家，抗生素在自然水體中被頻繁檢出，對人類健康及水生生態環境穩定產生了巨大的威脅[4]。磺胺類抗生素具有成本低、殺菌性廣等優點[5]，在人類和獸醫學中得到了廣泛的應用，我國磺胺類抗生素的年產量已達到20 000～50 000 t[6]592。人畜使用的磺胺類抗生素通常未被完全代謝，一部分以原藥或代謝物通過動物排泄物的形式排出體外進入環境[7]。目前，污水處理廠現有工藝對抗生素的去除效果不佳，這是導致自然環境中抗生素高殘留的重要原因之一[8]。研究表明，磺胺類抗生素在現有水環境中的檢出頻率最高，在我國黃浦江[9]和長江口[10]的水體中檢測率為100%，質量濃度為8.4 ng/L至211 μg/L。近年來，磺胺類抗生素可能引起的環境問題受到世界各國的高度重視[11-13]。磺胺類抗生素在畜禽及水產養殖業中的過度使用帶來了嚴重的危害，導致食用動物組織中磺胺類抗生素的殘留[14]。監測研究發現，磺胺類抗生素在水生生物體內的累積量可達1 150 μg/kg[6]593。另外，長期接觸抗生素的細菌會產生抗生素抗性基因[15]，抗生素抗性基因在水環境中的轉化和遷移可能比抗生素母體本身的殘留危害更大[16]。

磺胺甲惡唑是磺胺類抗生素的典型代表之一，可通過競爭性的抑制細菌二氫葉酸合成酶來阻斷葉酸代謝[17]。磺胺甲惡唑主要存在于水環境中，具有高度的穩定性，很難通過水解和生物降解途徑去除[18]。磺胺甲惡唑在地表水及污水處理廠中的檢出濃度相對較高，在加拿大格蘭德里弗河流域的城市干流中檢測到磺胺甲惡唑平均值為(31±24) ng/L[2]1581；在南非污水處理廠的上游和下游河流中，磺胺甲惡唑分別為(757.4±83.2)、(1 013.2±294.2) ng/L[19]。由于磺胺甲惡唑的長期殘留特性，目前磺胺甲惡唑對水生生態體系的影響尚不明確，亟需開展磺胺甲惡唑對水生生物的毒理學研究和水生生態風險評估來闡明這類抗生素的環境影響。本研究以磺胺甲惡唑為受試物，研究其對斑馬魚胚胎/仔魚的急性毒性及酶活性的影響，以期為評價環境中該抗生素的生態毒性及其環境風險提供基礎實驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

采用的AB品系斑馬魚購自南京大學模式生物研究中心，于生態環境部南京環境科學研究所育養室馴化2周以上，雌雄魚分別飼養，馴養期間無疾病和死亡。飼養條件：馴養魚用水為曝氣48 h以上的自來水，pH為7.82±0.5，溶解氧>5.0 mg/L，水質硬度為145.0 mg/L(以CaCO3質量濃度計)，照明條件為14 h光照/10 h黑暗交替進行，水溫控制在(26±2) ℃。

用二甲基亞砜(DMSO，分析純)做助溶劑，將磺胺甲惡唑(純度≥98%，美國化學文摘社(CAS)號為723-46-6)配制成質量濃度為100 g/L的儲備液(4 ℃冰箱避光保存)；考馬斯亮藍法蛋白含量測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)試劑盒及丙二醛(MDA)試劑盒。

體視顯微鏡(S8PAO)；紫外可見分光光度計(UVmini-1240)；人工氣候培養箱(MLR-351H)；手持式高速勻漿機(F6/10)；高速冷凍離心機(1-15PK)；6孔細胞培養板等。

1.2 供試生物準備

實驗前24 h停止喂食，實驗前1天傍晚，挑選16尾雌魚和16尾雄魚，按雌雄1∶1的數量比將斑馬魚分別放入8個繁殖盒中，中間用隔板隔開，將繁殖盒放入人工氣候培養箱中。次日早晨將隔板取出，用微弱的光照促進其產卵。2 h后收集受精卵，挑選發育正常的受精卵用去離子水清洗3次，用于毒性實驗。

1.3 急性發育毒性實驗

參考經濟合作與發展組織(OECD)魚類胚胎急性水生毒性實驗設計暴露實驗，實驗從卵子受精后盡早開始，暴露至96 h，最終得出96 h半數致死濃度(LC50)[20]。本實驗延長至120 h。設置6個磺胺甲惡唑暴露組(編號為1#～6#)，質量濃度分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L，設置空白對照組(CK)和溶劑對照組(DMSO)。以往研究表明，10 μg/L的磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎死亡率能產生顯著影響，但最高質量濃度組(10.0 mg/L)死亡率為13.1%[21]1071。本研究通過多次預實驗確定LC50范圍，正式實驗濃度根據預實驗結果設置，故顯得暴露濃度偏高，如果僅考慮環境濃度，將得不到顯示目標污染物的具體數值。實驗中，空白對照組采用曝氣48 h以上的自來水，溶劑對照組DMSO≤0.1%(體積分數，下同)，DMSO染毒實驗斑馬魚胚胎實驗表明，DMSO為0.1%對斑馬魚胚胎無明顯毒性。每個濃度組設3個平行，每組平行均放30枚斑馬魚胚胎，以6孔細胞培養板為實驗容器，每孔加入5枚斑馬魚胚胎和10 mL對應實驗組溶液。6孔細胞培養板蓋上蓋子以防止暴露過程中對應實驗組溶液蒸發，置于(26.0±0.5) ℃的光照培養箱中，光照周期為14 h光照/10 h黑暗。暴露期間每24 h更換一次對應實驗組溶液，及時挑出死亡個體以防止對其他胚胎造成影響。

每24 h通過體視顯微鏡觀察斑馬魚胚胎/仔魚的生長狀況，統計并記錄相關數據：24、48、72、96、120 h斑馬魚胚胎/仔魚死亡數，72、96 h斑馬魚胚胎孵化數，96 h斑馬魚仔魚心包囊腫數，96 h斑馬魚仔魚30 s心跳數及120 h斑馬魚仔魚體長。

1.4 抗氧化系統實驗

將受精2 h的斑馬魚胚胎隨機放入18個500 mL的玻璃缸中(每缸500枚胚胎)，每缸含有300 mL對應實驗組溶液。設置4個磺胺甲惡唑暴露組(編號為A#～D#)，質量濃度分別為10-2、10-1、1、10 mg/L，同時設置空白和溶劑對照組，每個濃度組設3個平行，胚胎培養條件與急性發育毒性實驗相同。暴露96 h后，每缸取200尾左右斑馬魚仔魚加入試劑盒提取液(每克魚體加入10 mL提取液)，冰浴勻漿，4 ℃以8 000 r/min離心10 min取上清液，按照試劑盒說明書進行酶活性檢測。

1.5 統計分析

采用SPSS 19.0軟件中的probit模塊對斑馬魚胚胎死亡毒性和發育抑制毒性進行分析，得到磺胺甲惡唑對斑馬魚的LC50、胚胎孵化率抑制的半數有效濃度(EC50)及其相應95%置信區間。在滿足正態分布和方差齊性的前提條件下，采用單因素方差分析法和最小顯著性檢驗法(LSD)分析各組間的差異顯著性，否則采用非參數檢驗來檢驗處理之間差異的顯著性，結果以平均值±標準差表示。用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎/仔魚急性致死的影響

磺胺甲惡唑能在水中穩定存在，在魚類體內具有生物富集性，對發光菌、大型蚤、魚類、藻類等具有不同程度的毒性[22]。LIN等[21]1070研究表明，低質量濃度(10 μg/L)的磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎/仔魚有明顯的毒性效應作用，其中最敏感的生物毒理學指標為死亡率。由圖1可知，暴露24～96 h時，3 000 mg/L暴露組斑馬魚胚胎/仔魚死亡率極顯著升高，其他組均沒有顯著性變化；隨暴露時間的延長，暴露120 h時斑馬魚胚胎/仔魚的死亡率隨著磺胺甲惡唑濃度的升高呈現上升趨勢，1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L暴露組斑馬魚胚胎/仔魚死亡率均極顯著高于空白和溶劑對照組。磺胺甲惡唑暴露下，斑馬魚胚胎/仔魚96、120 h的LC50分別是8 722.6、1 250.5 mg/L，隨磺胺甲惡唑暴露時間的延長，LC50降低，本研究中磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎/仔魚的LC50顯著高于LIN等[21]1071的研究結果。

2.2 磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎/仔魚發育毒性的影響

2.2.1 斑馬魚胚胎孵化

受精后48 h，正常發育的斑馬魚胚胎開始孵化。

注：“*”表示P<0.05，具有顯著差異；“**”表示P<0.01，具有極顯著差異。圖2、圖4、圖5和圖6同。

圖1 磺胺甲惡唑暴露120h內斑馬魚胚胎/仔魚死亡率
Fig.1 Mortality ofDaniorerioembryos/larvae exposure to
sulfamethoxazole during 120 h

由圖2可知，暴露72 h后，空白和溶劑對照組斑馬魚胚胎的孵化率均高于75%，500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L暴露組斑馬魚胚胎孵化率較對照組均極顯著下降，500 mg/L暴露組孵化率為60.9%，其余各暴露組均低于10%。隨暴露時間的延長，暴露96 h時各實驗組斑馬魚胚胎孵化率均上升，空白和溶劑對照組孵化率均達到100%，500 mg/L暴露組與對照組無明顯差異，其他暴露組均極顯著低于對照組。磺胺甲惡唑對斑馬魚胚胎96 h孵化率抑制的EC50為1 299.7 mg/L。磺胺甲惡唑暴露可能導致斑馬魚胚胎卵膜變薄[23]，胚胎更易受到外界磺胺甲惡唑的影響，延遲胚胎孵化，隨暴露時間的延長，導致斑馬魚胚胎死亡率升高。當暴露時間達到120 h、暴露質量濃度≥1 000 mg/L時，斑馬魚胚胎死亡率顯著上升，胚胎由透明變成白色半透明。

圖2 磺胺甲惡唑暴露對斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.2 Effect of sulfamethoxazole on Danio rerio embryos hatching rate

2.2.2 斑馬魚胚胎/仔魚形態

由圖3可見，暴露在磺胺甲惡唑溶液中的斑馬魚胚胎/仔魚發育異常的表現主要包括心包囊腫、脊柱彎曲及尾部畸形。

注：PC表示心包囊腫，SC表示脊柱彎曲。圖3 磺胺甲惡唑暴露后斑馬魚胚胎/仔魚形態異常Fig.3 Effect of sulfamethoxazole on the development of Danio rerio embryos/larva

由圖4可見，暴露在1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L暴露組斑馬魚仔魚患心包囊腫率較對照組極顯著上升，其中3 000 mg/L暴露組斑馬魚仔魚心包囊腫率高達71.30%。由此可見，磺胺甲惡唑對受精后96 h的斑馬魚胚胎/仔魚患心包囊腫影響的無可觀測效應質量濃度(NOEC)為1 000 mg/L。

圖4 磺胺甲惡唑暴露96 h后斑馬魚仔魚心包囊腫率Fig.4 Rate of Danio rerio larva’s pericardial cyst exposed to sulfamethoxazole after 96 h

由圖5可見，空白及溶劑對照組斑馬魚仔魚體長分別為(3.71±0.06)、(3.68±0.10) mm，30 s心跳數為88.33±1.15、86.67±1.53，無顯著性差異。2 000、2 500、3 000 mg/L暴露組斑馬魚仔魚體長較對照組顯著或極顯著下降，分別為(3.60±0.04)、(3.62±0.03)、(3.58±0.01) mm。由此可知，磺胺甲惡唑對受精后120 h斑馬魚仔魚體長的NOEC為1 500 mg/L。1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L暴露組斑馬魚仔魚30 s心跳數顯著或極顯著低于對照組。由此可見，磺胺甲惡唑對受精后96 h斑馬魚仔魚30 s心跳數影響的NOEC為500 mg/L。

圖5 磺胺甲惡唑暴露對斑馬魚仔體長和30 s心跳數的影響Fig.5 Effect of sulfamethoxazole on body length and 30 s’ heart beats of Danio rerio larva

總之，通過觀察斑馬魚胚胎/仔魚的形態，磺胺甲惡唑對胚胎的影響主要表現為心包囊腫和心率下降，對仔魚的影響主要表現為體長縮短。當磺胺甲惡唑暴露質量濃度≥1 500 mg/L時，斑馬魚胚胎患心包囊腫率較對照組極顯著升高，呈現劑量—效應關系。心包囊腫一旦形成就會一直存在于胚胎發育過程中，改變仔魚的心臟結構而威脅仔魚生存[24]。磺胺甲惡唑暴露還會損害斑馬魚心臟的功能，暴露質量濃度≥1 000 mg/L時，斑馬魚胚胎心率較對照組明顯降低。磺胺甲惡唑暴露對斑馬魚胚胎的心臟發育具有顯著的毒性作用，在結構和功能上影響斑馬魚的心臟發育。

2.3 磺胺甲惡唑對斑馬魚仔魚抗氧化系統的影響

由圖6可見，經磺胺甲惡唑暴露的斑馬魚仔魚CAT酶活性極顯著降低，SOD、GST酶活性及MDA含量極顯著升高。

研究報道，磺胺甲惡唑暴露可誘導顫蚓體內產生氧化脅迫反應，其中CAT在顫蚓的抗氧化系統防御中起著重要作用[25]595。生物體內氧化劑和抗氧化劑比例失衡會產生氧化應激，活性氧的過量產生會對細胞結構造成嚴重的損傷[26]。生物體內的多種抗氧化劑可以有效消除過量的活性氧[27]，SOD可催化活性氧轉換成H2O2，CAT能促使H2O2分解成氧分子和水。GST能催化谷胱甘肽(GSH)與多種鹵代化合物和環氧化合物結合，從而保護細胞免受氧化應激[28]。本研究發現，斑馬魚仔魚體內SOD、CAT、GST和MDA對磺胺甲惡唑均十分敏感，產生顯著性變化質量濃度遠低于96 h LC50(8 722.6 mg/L)。與對照組相比，10-2mg/L暴露組斑馬魚胚胎中SOD酶活性極顯著增加，隨暴露濃度的增加，SOD酶活性呈上升趨勢。這可能是由于暴露在磺胺甲惡唑中，斑馬魚仔魚體內的自由基含量增加，為清除這些過剩的自由基，SOD酶活性被顯著誘導，以免機體受氧化損傷。李亞寧等[25]599研究了磺胺甲惡唑對顫蚓體內抗氧化系統的影響，1.00 mg/L的磺胺甲惡唑能顯著誘導顫蚓體內SOD酶活性。本研究中磺胺甲惡唑對斑馬魚仔魚SOD酶活性產生顯著誘導的濃度遠低于顫蚓。CAT是生物防御體系的關鍵酶之一，與對照組相比，10-2mg/L暴露組斑馬魚仔魚體內CAT酶活性極顯著降低，且隨暴露濃度的增加而下降。聞洋等[29]發現，4種典型獸用抗生素在1 000 mg/L的暴露質量濃度下未能激活成魚體內的CAT酶活性。而本研究中磺胺甲惡唑對斑馬魚仔魚體內CAT酶活性產生顯著抑制質量濃度遠低于1 000 mg/L，磺胺甲惡唑對斑馬魚仔魚體內CAT酶活性的變化更敏感。隨著斑馬魚仔魚體內自由基和過氧化物的累積，對細胞結構造成損傷，進而CAT酶活性被顯著抑制。本研究中磺胺甲惡唑暴露組斑馬魚仔魚體內GST酶活性較對照組極顯著增加，為適應磺胺甲惡唑在斑馬魚仔魚體內的累積，胚胎通過提高GST酶活性來促進磺胺甲惡唑與GSH結合，進而克服氧化應激。卜兆宇等[30]與本研究得到一致的結論，磺胺甲惡唑急性暴露能導致斑馬魚體內CAT酶活性降低，SOD和GST酶活性增加。污染物暴露對魚類抗氧化系統酶活性的變化較復雜，相關酶活性的變化指示了斑馬魚仔魚體內的解毒過程。研究表明，在磺胺甲惡唑暴露過程中，為避免斑馬魚仔魚受到氧化損傷，抗氧化防御系統中SOD最先發揮作用，由于磺胺甲惡唑暴露使得斑馬魚仔魚體內產生的氧化物質超過了防御能力，最終導致斑馬魚仔魚機體結構和功能受到損傷。

圖6 磺胺甲惡唑暴露96 h后對斑馬魚抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of sulfamethoxazole on activity of antioxidant enzyme of Danio rerio after 96 h

MDA作為環境污染物毒性效應的敏感指示物，通常用于評估生物體的氧化損傷程度[31]。本研究中磺胺甲惡唑暴露組MDA含量較對照組差異極顯著，隨著暴露濃度的增加，MDA含量升高。表明磺胺甲惡唑對斑馬魚仔魚造成明顯的氧化損傷，誘導斑馬魚仔魚發生氧化應激反應，使得體內的抗氧化防御系統啟動，SOD和GST在斑馬魚胚胎的抗氧化系統防御中起著關鍵作用。但體內的活性氧不能被抗氧化系統完全清除，進而導致氧化損傷程度加劇。氧化損傷僅是魚類對污染物毒性響應之一，未來需開展更多關于潛在高風險污染物對魚類制毒機制方面的研究。