EMA結合實時熒光PCR方法檢測單核細胞增生李斯特氏菌

吳海江，孫玉萍，范田麗，趙建勇，張煌濤，張曉波，楊珊珊

（1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院/國家農副產品質量監督檢驗中心，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫科大學基礎醫學院，新疆 烏魯木齊830054）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種食源性致病菌，可在冰箱冷藏室生長繁殖[1-2]。人感染后引起腦膜炎、流產、敗血癥等疾病，致死率達20%～30%，美國每年近300人死亡[3]。我國非常重視L.monocytogenes污染，要求預包裝食品檢出率為零，因此準確快速檢測成為研究熱點[4-5]。

目前，L.monocytogenes檢測方法有生理生化[6]、酶聯免疫方法[7]等，操作繁雜、試劑成本高，確定陽性樣品需要5～8 d[8]。實時熒光PCR檢測具有高效準確、操作簡單、減少交叉污染等優點[9]。利用核酸熒光染料疊氮溴化乙錠（EMA）與死菌DNA共價結合阻斷PCR反應[10-11]，通過qPCR循環次數（Ct值）增加區分死菌。Casini等[12]監測醫院直飲水中軍團菌（Legionella）。有研究表明，脫氧膽酸鈉溶液（SD）處理受損細胞，增強EMA滲入。Wang等[13]用0.1%SD處理腸出血性大腸埃希氏菌O157，抑制效果增強。

TaqMan熒光水解探針特異性強、高通量[14-15]。hly基因編碼李斯特溶血素O（LLO）是L.monocytogenes重要的致病物質，導致細菌在巨噬細胞、上皮細胞中傳播[16]。作者設計引物、TaqMan探針檢測hly基因，將EMA與qPCR結合鑒別活菌，嘗試SD強化抑制效果，人工污染樣品測試實用性。本方法操作簡單、準確可靠，為食品、環境中檢測L.monocytogenes提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

56株標準菌株：購自美國種質保藏中心（ATCC）、英國典型菌種保藏中心（NCTC）、中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國醫學細菌保藏管理中心（CMCC），分離株由國家農副產品質量監督檢驗中心（新疆）分離保存。

1.2 主要試劑和儀器

EMA：購自美國Sigma公司；細菌DNA提取試劑：購自上海生工公司；qPCR反應試劑Premix Ex Taq（含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+等）：購自日本Takara寶生物公司；SD：購自北京雷根生物技術有限公司；微生物培養基：購自北京陸橋有限公司。

Dry Block Heater 2金屬干浴器：德國IKA公司；ROTINA 420離心機：德國Hettich公司；VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀：法國生物梅里埃公司；LED光照裝置（等效于鹵素燈600 W）：日本Takara寶生物公司；CFX96熒光定量PCR儀：美國伯樂Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物的培養將L.monocytogenes、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌（O-157:H7）等標準菌株、實驗室分離株用腦心浸出液肉湯（BHI）復蘇，VITEK 2 Compact確認。將單菌落接種于10 mL緩沖蛋白胨水（Buffered peptone water，BPW）試管中，36℃過夜培養至對數期。

1.3.2 熱致死方法取培養至對數期L.monocytogenes的新鮮菌液，調整菌懸液為0.5麥氏濁度（約1.5×108CFU/mL），取1 000μL至1.5 mL離心管中，金屬干浴80℃加熱10 min，冷卻至室溫。活菌置于冰盒中避免繁殖擴增。吸取菌液300、300、400μL，涂布于顯色培養基，36℃培養48 h觀察生長情況，計算菌落數量。

1.3.3 最適EMA質量濃度及DNA提取將EMA溶解制成質量濃度2.5 mg/mL母液，-20℃避光保存。將EMA加入菌液，用渦旋振蕩器混勻，每管終質量濃度為0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL。暗處避光、室溫靜置15 min，過程中每隔2～3 min用手輕彈混勻。暗反應后，用LED裝置光照15 min（或500 W鹵素燈，距離20 cm，光照15 min）。細菌DNA通過上海生工試劑提取，4℃保存備用。

1.3.4 qPCR引物探針設計以L.monocytogenes溶血蛋白基因hly（Genbank accession no.M24199）為目的基因，使用Primer Express 3.0軟件設計引物、TaqMan探針，美國Thermo Fisher賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成。

qPCR反應體系（25μL）：12.5μL Premix Ex Taq；10μmol/L上、下游引物、探針各0.5μL；DNA模板2.0μL；用ddH2O補至25μL。反應程序：95℃30 s、95℃5 s、60℃30 s（收集FAM熒光），40個循環。通過Bio-rad伯樂CFX Manager Software軟件分析實驗數據。

表1 引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probe

1.3.5 EMA-qPCR方法檢出限將0.5麥氏濁度的L.monocytogenes活菌（約1.5×108CFU/mL）進行10倍梯度稀釋，制得濃度為106、105、104、103、102CFU/mL菌液，EMA處理和未處理菌液同時進行qPCR檢測，確定方法檢出限。

1.3.6 SD增強EMA-qPCR效果將體積分數1%SD分別加入熱致死、活L.monocytogenes培養液中，使SD終體積分數為0.01%、0.03%、0.1%。充分混勻后，暗處避光、室溫靜置20 min，過程中每隔6～7 min用手輕彈混勻后，后續按1.3.3處理，選擇最適質量濃度EMA處理進行qPCR檢測。

1.3.7 人工污染樣品檢測從超市、商場、垃圾處理站采集食品、環境樣品73份，包括鹵雞肉、牛奶、肉餡、垃圾滲濾液。經高溫滅菌后，25 g樣品分別加入L.monocytogenes死菌、活菌，增菌液至0.3～0.5麥氏濁度時，食品安全國家標準GB 4789.30-2016[17]定性法和EMA-qPCR方法檢測L.monocytogenes。

2 結果與分析

2.1 實驗原理

EMA進入熱致死L.monocytogenes細胞經可見光曝光，所帶的光敏性基團（-N3）脫去（-N2）轉化為高活性的氮賓中間體，與DNA鏈上碳氫化合物結合形成不可逆的共價鍵（-NH-CH2-），造成DNA永久修飾抑制PCR反應[18]。EMA處理死菌Ct值增加，實現消除“假陽性”特異性檢測活菌，見圖1。

圖1 檢測單增李斯特氏菌活菌示意圖Fig.1 Overall process of EMA-qPCR assay for detection of live Listeria monocytogenes

前增菌采用非選擇BPW培養基，適用于L.monocytogenes、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲菌等食品致病菌在食品加工熱處理及防腐劑添加過程中的損傷恢復和增菌培養。本研究方法可同時檢測多種致病菌，細菌DNA提取全過程在一個離心管中完成，裂解液直接qPCR檢測，操作簡單，防止交叉污染。

2.2 qPCR檢測特異性

實驗重要因素是引物、TaqMan探針對編碼李斯特溶血素O（LLO）基因hly靈敏性和特異性。通過檢測56株常見的致病菌，包括L.monocytogenes、李斯特菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、蠟樣芽胞桿菌等，結果僅有L.monocytogenes準確擴增檢測，其他菌株的Ct值均大于35或無Ct值（無信號），無交叉反應，表明方法有高度特異性，見表2。

表2 驗證qPCR方法檢測L.monocytogenes特異性菌株Table 2 Strains used for validation in qPCR assay for identification of Listeria monocytogenes

2.3 最適EMA質量濃度

隨著EMA質量濃度的增大，熱致死L.monocytogenes的Ct值升增加。當EMA質量濃度為2.5μg/mL時，有效抑制熱致死菌DNA擴增，EMA無法進入活菌細胞內，Ct值增幅可以忽略，與未處理的熱致死菌相比，Ct值相差6。EMA質量濃度大于5.0μg/mL，死菌Ct值增幅不明顯，影響效果接近飽和；EMA進入活菌影響結果，活菌Ct值增加。選取最適質量濃度為2.5μg/mL，經過EMA處理樣品菌液qPCR結果增加5以上，判定含有L.monocytogenes死菌，見圖2—3。

圖2 不同質量濃度EMA對活及熱致死L.monocytogenes影響Fig.2 Effect of different EMA concentrations on qPCR signals of live and heat-killed Listeria monocytogenes

圖3 比較EMA質量濃度為2.5μg/mL對活及熱致死L.monocytogenes的qPCR擴增Fig.3 Comparison of DNA amplification of live and heat-killed Listeria monocytogenes treated with 2.5μg/mL EMA in the qPCR assay

2.4 檢出限

將0.5麥氏濁度L.monocytogenes（約1.5×108CFU/mL）活菌10倍梯度稀釋，用質量濃度2.5μg/mL EMA處理菌液，與未處理菌液進行qPCR實驗。結果顯示，EMA處理與未處理qPCR結果近似，低質量濃度EMA影響較小，標準曲線R2=0.991。菌液濃度為150 CFU/mL時，實驗結果Ct值為34.7。EMAqPCR方法檢測L.monocytogenes的檢出限為150 CFU/mL，見圖4。

圖4 L.monocytogenes活菌10倍梯度稀釋2.5μg/mL EMA處理和未處理qPCR檢測結果Fig.4 A serial of 10-fold-diluted live Listeria monocytogenes cell dilutions were treated with EMA or without EMA

2.5 SD增強EMA-qPCR效果

當SD體積分數由0.01%增至0.1%，EMAqPCR檢測結果顯示，L.monocytogenes活菌Ct值增加。SD體積分數為0.1%時，活菌Ct值為31。分析原因，L.monocytogenes屬于革蘭氏陽性菌，對膽鹽敏感，膽鹽通常作為分離革蘭氏陰性菌抑制劑，如沙門氏菌、腸出血性埃希氏菌分離培養時使用[19]。高體積分數SD導致活L.monocytogenes細胞膜受損，EMA進入菌體，影響qPCR檢測。結果說明SD不適合L.monocytogenes作為EMA-qPCR方法的前處理，見圖5。

圖5 不同體積分數SD處理對L.monocytogenes活菌、熱致死菌EMA-qPCR檢測影響Fig.5 Effect of exposure of live and heat-killed Listeria monocytogenes to EMA in the presence of different concentrations of sodium deoxycholate(SD)

2.6 人工污染樣品

人工污染樣品包括18份鹵雞肉、19份牛奶、29份肉餡和8份垃圾滲濾液，共計73份。陰性樣本加入熱致死L.monocytogenes，EMA-qPCR方法快速鑒別與傳統培養法一致，共計42份陽性樣本，30份陰性樣本，結果準確率100%，表明本方法良好的實用性和可靠性，見表3。

表3 EMA-qPCR方法和傳統培養法檢測人工污染L.monocytogenes樣品結果Table 3 Result of EMA-qPCR method compared to the traditional culture method for identification of Listeria monocytogenes in artificial contaminated samples

3 結語

近年來，國家市場監督管理總局組織食品監督安全抽檢顯示，微生物污染問題占比較大，許多產品不合格由微生物造成，餐飲領域、環境污水檢測致病菌都缺少高效方法。因此，建立快速準確的檢測方法對食品安全和環境保護有重要意義。王靜等[20]應用PMA-ddPCR方法檢測食品中106 CFU/mL滅活沙門氏菌。本研究可直接用qPCR方法檢測L.monocytogenes，也可以結合EMA處理檢測L.monocytogenes活菌，打消PCR方法無法檢測活菌的疑慮。與傳統培養法5～8 d相比，EMA-qPCR檢測方法24 h完成（包括前增菌、DNA提取、EMA處理和qPCR實驗），期待可成為標準檢測方法，未來應用于批量檢測樣品的自動化儀器。