鱗杯傘可溶性蛋白提取工藝的優化及其營養評價

王江，王術榮，郭富寬，常明昌，*，孟俊龍

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.黃土高原食用菌提質增效協同創新中心，山西太谷030801）

山西省特色野生食用菌種質資源豐富，臺蘑久負盛名。臺蘑泛指生長于五臺山生態區上的一些優質野生食用菌類，主要品種有臺蘑小香蕈、黑水皮香蕈、銀盤蘑菇、虎皮香蕈、秋露白等[1]。臺蘑味香濃郁，營養豐富，具有驅風散寒、舒筋活血、降低膽固醇、防止動脈硬化、調節人體免疫等保健功效[2-3]。目前，關于臺蘑的研究主要集中于種質資源調查[4-5]、營養成分分析[6]和生物學特性及其人工馴化栽培等方面[7-8]。

黑水皮香蕈學名鱗杯傘（Clitocybe squamulosa），隸屬于白蘑科（Tricholomataceae）杯傘屬（Clitocybe），主要生長于五臺管涔山的云杉、落葉松林內草地上；鱗杯傘是野生臺蘑中的營養價值極高的一種，其質地柔嫩、風味獨特；關于其營養成分分析、生物活性蛋白分離提取及營養價值評價等研究尚未有報道。據此，筆者對鱗杯傘子實體的主要營養成分進行分析的基礎上，采用堿溶酸沉法制備活性蛋白，通過探索其最佳提取工藝參數，并對所獲取得蛋白氨基酸組分進行營養價值分析和評價；以期為鱗杯傘蛋白的制備及進一步的功能性食品的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鱗杯傘[Clitocybe squamulosa（Pers.）Kumm]：山西食用菌工程技術研究中心提供，放置于烘箱中35 ℃下烘干、粉碎、過60 目篩備用；牛血清蛋白標準品：北京百奧萊博科技有限公司；考馬斯亮藍G250 試劑：上海瀚思化工有限公司；濃鹽酸：恒泰化工有限公司；氫氧化鈉：南京盛慶和化工有限公司；無水乙醇、磷酸：天津市凱通化學試劑有限公司（以上試劑均為分析純）。

1.2 主要儀器

TB-214 型電子分析天平：北京賽得利斯儀器系統有限公司；GZX-9240MBE 型電恒溫鼓風干燥箱：上海博訊實業有限責任公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵：邦西儀器科技有限公司；DF-101S 磁力攪拌器：北京中興偉業儀器有線公司；MultifugeX1R Centrifuge 離心機：美國THERMO 有限責任公司；德國Christ ALPHA 2-4 LSC 冷凍干燥機：德國格馬有限責任公司；UV-1800 紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；DE-200 紅景天高速超微粉碎機：天津市精誠機械有限公司；KDN-1 型全自動凱氏定氮儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；Biochrom-30+全自動氨基酸分析儀：英國biochrom/百康有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鱗杯傘子實體中基本成分的分析

蛋白質含量測定方法采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》，采用凱氏定氮法測定；水分含量測定方法采用GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》，將樣品放在（105±1）℃的烘箱中烘至恒重。脂肪含量測定采用GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；灰分含量測定采用，GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》，將樣品置于（550±25）℃高溫下煅燒4 h，稱量殘渣的質量；依次對子實體粉進行粗蛋白、水分、粗脂肪、灰分的測定[9]。碳水化合物含量的測定參照李茉[10]的方法，稱取樣品質量減去樣品中所測的水分、灰分、脂肪及蛋白質含量的總和。

1.3.2 鱗杯傘可溶性蛋白含量的測定

采用Bradford 法測定鱗杯傘蛋白提取液中可溶性蛋白的含量，以牛血清蛋白（albumin from bovine serum，BSA）作為標準蛋白，以考馬斯亮藍比色法在595 nm下測定吸光值，通過繪制蛋白標準曲線，見圖1。

圖1 考馬斯亮藍牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Coomassie brilliant blue bovine serum albumin standard curve

如圖1 所示，建立回歸方程為y=0.004 9x-0.002 6，其中 y 為所測吸光度，x 為蛋白濃度（μg/mL），R2=0.998 7。最后，根據標準曲線計算提取液中可溶性蛋白質的含量，以此來確定樣品的蛋白提取率。

1.3.3 鱗杯傘子實體蛋白提取的工藝流程

將烘干的鱗杯傘子實體粉過60 目篩→室溫下用正己烷料液比為1 ∶10（g/mL）脫脂→置于震蕩搖床脫脂2 h→連續用正己烷萃取兩次→靜置30 min→傾析出己烷→脫脂的樣品在空氣中干燥24 h 后備用；準確稱取脫脂子實體粉0.50 g 溶于不同pH 值與液料比的蒸餾中→調節溫度水浴震蕩提取→4 500×g/min 離心10 min→測定提取液中可溶性蛋白的含量→調節上清液至鱗杯傘蛋白等電點（pH 3.6）→靜置30 min→6 500×g/min 離心15 min→棄上清，將蛋白沉淀用少量去離子水溶解→調節pH 值至中性→真空冷凍干燥得到鱗杯傘粗蛋白粉。

1.3.4 可溶性蛋白提取率的計算

式中：X 為蛋白質提取率，%；C 為提取液中可溶性蛋白濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數；m1

為樣品的質量，mg。

1.3.5 可溶性蛋白提取的單因素試驗

利用單因素篩選鱗杯傘可溶性蛋白提取的最佳條件；由于提取過程中影響因素較多，為確定可溶性蛋白最佳的提取工藝，選取液料比、提取液pH 值、提取時間、提取溫度對鱗杯傘可溶性蛋白提取率的影響。

1.3.5.1 液料比對鱗杯傘蛋白提取率的影響

準確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調節液料比 10、20、30、40、50 mL/g，使用濃度為 0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調節提取液pH 值為9.5，提取溫度為（45±1）℃，提取時間 40 min。最后，將浸提液在 4 ℃離心（4 500×g/min，10 min），取上清液，采用考馬斯亮藍G-250 法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計算蛋白的提取率。

1.3.5.2 提取液pH 值對鱗杯傘蛋白提取率的影響

準確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調節液料比30 mL/g，使用濃度為0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調節提取液 pH 值為 6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，提取溫度為（45±1）℃，提取時間 40 min。最后，浸提液在 4 ℃下離心（4 500 ×g/min，10 min），取上清液，采用考馬斯亮藍G-250 法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計算蛋白的提取率。

1.3.5.3 浸提溫度對鱗杯傘蛋白提取率的影響

準確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調節液料比30 mL/g，使用0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調節提取液pH 值為10.5，震蕩水浴搖床溫度調節為 25、35、45、55、65 ℃，提取時間 40 min。最后，浸提液在 4 ℃下離心（4 500×g/min，10 min），取上清液，采用考馬斯亮藍G-250 法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計算蛋白的提取率。

1.3.5.4 浸提時間對鱗杯傘蛋白提取率的影響

準確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調節液料比為30 mL/g，使用0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調節提取液pH 值為10.5，震蕩水浴搖床溫度調節為 45 ℃，浸提時間調節為 20、40、60、80、100 min。最后，浸提液在 4 ℃下離心（4 500×g/min，10 min），取上清液。采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計算蛋白的提取率。

1.3.6 響應面影響因素的確定

依據單因素試驗的篩選結果，采用Desig-expert 8.0.6 軟件，以鱗杯傘蛋白提取率為響應值，根據Box-Behnken Design 中心組合原理進行實驗設計，以液料比、提取液pH 值、提取溫度為變量，進行三因素三水平試驗設計，如表1 所示；以鱗杯傘可溶性蛋白的提取率為響應值，進行分析試驗參數。

表1 響應面三因素三水平響應面試驗設計Table 1 Experiment design of three factors and three levels of response surface method

1.3.7 鱗杯傘蛋白的氨基酸組成與營養價值分析

準確稱取凍干的鱗杯傘粗蛋白樣品200 mg，置于安瓿中加6 mol/L HCl 溶液定容至10 mL。通入氮氣迅速封口后，置于110 ℃烘箱內鹽酸水解22 h，將安瓿管取出后迅速冰水浴冷卻至室溫。然后，將蛋白水解液經濾紙過濾后，用0.01 mol/L HCl 定容至50 mL 的容量瓶，然后準確吸取水解液2.0 mL，置于60 ℃下真空旋轉蒸干；繼續加入0.02 mol/L HCl 溶液2.0 mL，過0.45 μm 濾膜，即得酸水解液[11]。Biochrom+氨基酸自動分析儀器，上樣取20 μL 水解液，分析樣品蛋白中水解氨基酸的組成與比例含量；最后，根據氨基酸平衡理論FAO/WHO 的必需氨基酸模式，通過計算氨基酸的化學評分（amino acid score，AAS）來評價鱗杯傘蛋白的營養價值[12-13]。

2 結果與分析

2.1 鱗杯傘子實體粉中基本成分分析

鱗杯傘子實體樣品的主要營養成分，如表2 所示。

表2 鱗杯傘子實體的主要成分分析Table 2 Analysis of main components of Clitocybe squamulosa（Pers.）Kumm %

通過分析可以發現鱗杯傘子實體粉中脂肪含量僅有3.27%，粗纖維含量為8.16%，碳水化合物為40.96%，總蛋白含量高達38.57%。據相關報道；猴頭菇蛋白的含量為26.3%，白靈菇為25%左右，香菇為19.9%，而平菇為10.5%[14]，鱗杯傘子實體中蛋白的含量遠高于多數的食用菌。

2.2 單因試驗結果分析

2.2.1 液料比對蛋白提取率的影響

在提取溫度45 ℃、提取時間40 min、提取液pH 9.5的條件下，探究提取料液比對鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖2。

圖2 液料比對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on protein extraction rate

如圖2 所示，當液料比在10 mL/g～30 mL/g 范圍內，鱗杯傘可溶性蛋白的提取率，隨液料比增加呈顯著增加的趨勢；當液料比達到30 mL/g 時，可溶性蛋白的溶解度達到飽和，若繼續提高液料比增加可溶性蛋白質分子與水分子之間的相互作用，使得蛋白分子在等電點處不易沉淀，導致蛋白在濃縮時殘留率增加[15-16]。因此，篩選最佳的液料比為30 mL/g。

2.2.2 提取液pH 值對蛋白提取率的影響

在提取溫度45 ℃、提取時間40 min、液料比為30 mL/g 的條件下，探究浸提液pH 值對鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖3。

圖3 提取液pH 值對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH on protein extraction rate

如圖3 所示，樣品可溶性蛋白的提取率，隨著浸提液pH 值升高，可溶性蛋白的提取率呈上升趨勢；當浸提液pH 值達到11.5 時，提取液色澤變得越來越深，呈現明顯的黑褐色；可能是堿液濃度對蛋白分子中的次級鍵，導致脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應，產生有毒縮和氨基酸化合物，最終導致蛋白質營養價值降低[17]。綜合考慮；可溶性蛋白最佳的提取pH 值為10.5

2.2.3 提取溫度對蛋白得率的影響

在液料比為30 mL/g、提取液pH 值為10.5、提取時間40 min 條件下，探究提取溫度對鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖4。

圖4 提取溫度對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on protein extraction rate

如圖4 所示，隨著提取溫度的升高，可溶性蛋白質與水分子之間相互作用，增加了蛋白的溶解性，當提取溫度在45 ℃時蛋白的提取率基本保持穩定；若繼續提高蛋白的提取溫度時，可能會導致部分可溶性蛋白變性[18]。因此，選取最佳的提取溫度為45 ℃。

2.2.4 提取時間對蛋白得率的影響

在液料比為30 mL/g、提取液pH 值為10.5、提取溫度45 ℃的條件下，探究浸提時間對鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖5。

如圖5 所示，在鱗杯傘子實體粉在水浴震蕩浸提的初期，隨著提取時間延長，蛋白質提取率呈現顯著增長的趨勢，浸提時間到60 min 時，可溶發性蛋白的提取率保持穩定；選取蛋白浸提時間為60 min。此時，樣品蛋白的溶出量達到飽和時，可溶性蛋白的溶出率已趨于平衡[19-20]。

2.3 Box-Behnken試驗設計與分析

Box-Behnken 中心組合因素水平編碼見表3。

圖5 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of time on protein extraction rate

表3 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼Table 3 Independent variables and coded levels in Box-Behnken experimental design

2.4 Box-Behnken試驗設計與回歸模型方差分析結果

以 X1、X2、X3為響應變量，以鱗杯傘蛋白提取率為響應值，由表3 數據進行分析處理，得到表4 回歸方程方差分析表；利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行非線性的二次多項式擬合，得到多元二次回歸方程如下：

式中：Y 為鱗杯傘可溶性蛋白提取率，%；X1、X2和X3分別為液料比、提取液pH 值、提取溫度作為3 個自變量的編碼值。鱗杯傘可溶性蛋白提取率與回歸方程預測值的相關系數R2=0.965 8，擬合狀況良好，表明回歸模型方案可行。

通過建立此模型對試驗數據進行理論推測，回歸方程的系數進行顯著性檢驗；結果如表4 所示，經分析結果，該模型 P＜0.01；其中項差異極顯著項差異顯著；X1X3、X2X3項差異不顯著。因此，該模型有實際應用的意義，擬合的二次回歸方程具有良好的顯著性；可溶性蛋白的提取率失擬項P 值0.866 1＞0.05，失擬項差異不顯著；此外，該模型F值為21.53，由自變量F 值大小可以得出，這三個因素對蛋白提取率的影響順序依次是X2＞X3＞X1，即提取液pH 值＞提取溫度＞液料比。

表4 回歸分析結果Table 4 Results of regression analysis

2.5 響應面模型條件優化及驗證

利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行計算與分析，得到鱗杯傘子實體可溶性蛋白提取最佳工藝條件為：液料比為31.24 mL/g、提取液pH 值為11.06、提溫度為50.51 ℃、浸提時間為60 min，在此條件下，響應值鱗杯傘蛋白提取率為33.71%。考慮到實際應用的可行性，將提取條件調整為液料比為31 mL/g、提取液pH 值為11.00、提取溫度為51℃浸提時間為60 min，在此條件下做3 次平行試驗的蛋白提取率為（33.65±0.17）%，經SPSS 軟件顯著性分析，實際蛋白得率稍低于理論值，差異不顯著（P＞0.05）。因此，表明采用響應面法優化的模型可靠。

2.6 鱗杯傘蛋白氨基酸組成及營養價值評價

采用堿溶酸沉法制備獲得鱗杯傘蛋白中含有17種氨基酸（色氨酸未測），其中蛋白營養價值的優劣主要取決于所含必需氨基酸（essential amino acid，EAA）的種類、數量和組成比例[21]。鱗杯傘蛋白中所含的必需氨基酸組成比例越接近人體需要氨基酸的比例，則其營養價值就越高。通過測定與分析樣品蛋白水解氨基酸的結果表明；此蛋白中必需氨基酸的比例接近FAO/WHO 的推薦值，能夠滿足人體對于氨基酸的基本需求。Biochrom+氨基酸自動分析儀測定鱗杯傘蛋白氨基酸組分色譜圖如圖6 所示，蛋白樣品中氨基酸組分的含量及其營養價值分析見表5 所示。

圖6 鱗杯傘蛋白氨基酸分析色譜圖Fig.6 Clitocybe squamulosa protein amino acid analysis chromatogram

表5 鱗杯傘蛋白氨基酸的組分含量及營養價值分析Table 5 Analysis of component content and nutritional value of clitocybe squamulosa amino acids

3 結論與討論

本研究通過單因素試驗篩選堿溶酸沉法制備鱗杯傘蛋白的提取條件，并在此基礎上采用Box-Behnken響應面試驗設計得到最佳提取工藝參數：液料比為31.24 mL/g、提取液 pH 值為 11.06、提溫度為 50.51 ℃、浸提時間為60 min，在此條件下，鱗杯傘子實體蛋白理論提取率達33.71%。通過建立的回歸模型，其決定系數R2=0.965 8，回歸模型顯著，擬合程度好，能很好地預測堿溶酸沉法制備鱗杯傘可溶性蛋白的提取工藝參數。

通過進一步對提取的鱗杯傘蛋白氨基酸組分含量進行分析及營養價值評價；鱗杯傘蛋白中（除色氨酸外）含有17 種氨基酸，7 種是人體必需氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA 為39.35%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA/NEAA 為64.89%，均接近FAO/WHO 的推薦值。鱗杯傘蛋白氨基酸種類齊全，能夠滿足成人日常的需要，可以作為一種理想的蛋白質；其中鱗杯傘蛋白中所含的呈味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸）總量為總量的23.55 %，占總氨基酸的比例達到了45.59%。鱗杯傘蛋白呈味氨基酸的組成和比例含量，賦予其良好的風味與鮮味等特點，可以為進一步開發天然呈鮮味物質及其功能性風味食品的研究提供了理論依據。