馬鈴薯雪花全粉制酒工藝優(yōu)化

孫文，魏金艷，杜麗平，馬立娟，劉偉，黃峰

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實驗室，天津300457；3.天津科技大學(xué)天津工業(yè)微生物重點(diǎn)實驗室，天津300457；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

馬鈴薯，別名土豆、山藥蛋、荷蘭薯、藩芋等，是除水稻、小麥、玉米以外的主要糧食作物，同時又是重要的工業(yè)原料，具有較高的食用價值和開發(fā)價值[1]。我國馬鈴薯產(chǎn)量居世界第一，并且在逐年增加，2016～2017年度中國馬鈴薯產(chǎn)量達(dá)到一億噸[2]。對于馬鈴薯資源的有效利用，農(nóng)業(yè)部在2015 年提出馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，要將馬鈴薯開發(fā)成多樣化的產(chǎn)品，提高馬鈴薯的經(jīng)濟(jì)效益。馬鈴薯雪花全粉是將鮮馬鈴薯經(jīng)過清洗、去皮、切片、預(yù)煮、冷卻、蒸煮、制泥、滾筒干燥等工藝制成的一種深加工產(chǎn)品，該過程保留了較多的鮮馬鈴薯所具有的營養(yǎng)物質(zhì)，脫去了馬鈴薯的大量水分從而便于運(yùn)輸和儲存[3]。

目前國內(nèi)許多學(xué)者研究了馬鈴薯的酒精發(fā)酵工藝，并進(jìn)行了優(yōu)化，周霞等[4]用糯米粉與馬鈴薯雪花全粉按添加質(zhì)量比為1 ∶5，發(fā)酵7 d 得馬鈴薯酒精發(fā)酵液的酒精度為7.9%vol。李興革等[5]利用馬鈴薯為原料，生產(chǎn)酒精，并對發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究，原料出酒率達(dá)到17.12%。王金華等[6]以馬鈴薯淀粉為原料，以出酒率為評價指標(biāo)，研究了不同溫度、不同糖化酶對出酒率的影響，代淑梅等[7]研究了料水比、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等因素對馬鈴薯發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。周廣麒等[8]研究了影響馬鈴薯發(fā)酵產(chǎn)酒精的幾個因素包括發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、料水比，同時還利用馬鈴薯干粉為原料進(jìn)行濃醪發(fā)酵，酒精濃度達(dá)到16.3%vol。Gao M T 等[9]分析了馬鈴薯漿成分，并利用馬鈴薯漿發(fā)酵產(chǎn)乙醇。Marija B Tasic等[10]對利用馬鈴薯塊莖生產(chǎn)燃料乙醇的過程進(jìn)行了模擬研究。

高級醇，又叫雜醇油，對白酒的芳香和口味都有貢獻(xiàn)，還是生成酯的前體物質(zhì)，但飲用高級醇含量高的酒會對身體造成損害，國標(biāo)規(guī)定白酒中雜醇油的含量不得超過0.15 g/100 mL[11]，所以需要控制發(fā)酵醪液中的高級醇含量。

主要研究了以馬鈴薯雪花全粉為主要原料，以安琪釀酒活性干酵母為發(fā)酵劑，以酒中高級醇含量為評價指標(biāo)，結(jié)合發(fā)酵理化指標(biāo)，優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵工藝制取馬鈴薯酒，從而為釀制馬鈴薯白酒提供理論依據(jù)，旨在充分利用馬鈴薯資源開發(fā)新型的酒精飲料產(chǎn)品，提高馬鈴薯深加工產(chǎn)品的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯雪花全粉：市售；安琪耐高溫釀酒活性干酵母（angel active dry yeast，ADY）：湖北宜昌安琪酵母公司；液化酶（150 000 U/mL）、糖化酶（290 000 U/mL）、固態(tài)蛋白酶（50 000 U/g）：北京諾維信公司；葡萄糖（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2001-1 型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司設(shè)備廠；Agilent 7890B 氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；LRH-250A 恒溫培養(yǎng)箱：廣東醫(yī)療器械廠；PC-1000 數(shù)顯式恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

馬鈴薯雪花全粉→熱水調(diào)漿→液化→糖化→蛋白酶解→冷卻接種→發(fā)酵→蒸餾

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 可溶性固形物的測定

可溶性固形物的測定采用PAL-1 手持糖度儀直接測定。

1.3.2.2 酒精濃度檢測

用量筒量取發(fā)酵液100 mL，轉(zhuǎn)入1 000 mL 錐形瓶中。用100 mL 水洗滌量筒，洗液并入蒸餾瓶中，加一滴消泡劑，安裝冷凝裝置，通入冷水，用原100 mL 量筒接取餾出液，小火加熱蒸餾20 min 左右，直至餾出液體積約100 mL 時，停止蒸餾。用水定容，搖勻。倒入100 mL量筒中，測量餾出液的溫度與酒精度。按測得的實際溫度和酒精度標(biāo)示值查酒精度溫度校正表折算成20 ℃時的酒精度[12]。

1.3.2.3 殘?zhí)堑臋z測

殘?zhí)堑臋z測采用斐林試劑法[13]。

1.3.2.4 總酸的測定

直接滴定法測定[14]。

1.3.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

1）酒樣預(yù)處理

取1 mL 待測酒樣用0.22 μm 孔徑濾膜過濾后，注入氣相小瓶，進(jìn)行高效氣相色譜測定。

2）氣相色譜條件

氣相色譜儀為Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A 自動進(jìn)樣器，色譜柱 Agilent1909N-213，30 m×0.32 mm×0.5 μm 毛細(xì)血管柱，檢測器為FID。進(jìn)樣口的溫度設(shè)置為200 ℃，檢測器的溫度為200 ℃。進(jìn)樣量條件：1 μL 的進(jìn)樣量，并設(shè)置為 5 ∶1 的分流比。載氣為高純度的氮?dú)猓魉僭O(shè)置為2.0 mL/min。升溫程序：起始柱溫設(shè)置為50 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min 的升溫速度上升至120 ℃，保持5 min[15-16]。

3）定量分析

定量分析采用外標(biāo)法定量。

1.4 工藝優(yōu)化試驗說明

1.4.1 單因素試驗

1.4.1.1 料水比的確定

馬鈴薯雪花全粉：熱水（70 ℃左右）按照1 ∶5.5、1 ∶6.0、1 ∶6.5、1 ∶7.0、1 ∶7.5（g/mL）混合均勻后，加入（10 U/g）液化酶，90 ℃液化 90 min，觀察醪液形態(tài)、流動性，用手持糖度計測定其含糖量。

1.4.1.2 發(fā)酵溫度的確定

馬鈴薯雪花全粉：熱水（70 ℃左右）按照1 ∶7.0（g/mL）料水比混合均勻后，加入液化酶（10U/g），90℃液化90min，冷卻到60 ℃加入糖化酶160 U/g 糖化30 min，冷卻到40 ℃，加蛋白酶 12 U/g 保持 20 min，冷卻到30 ℃按3 ∶10 000（按原料質(zhì)量計）接種活化好的ADY，在 20、25、30 ℃發(fā)酵5 d 后蒸餾，發(fā)酵結(jié)束后測定酒度、酒中風(fēng)味物質(zhì)、殘還原糖、總酸，試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.4.1.3 糖化酶添加量的確定

馬鈴薯雪花全粉：熱水（70 ℃左右）按照1 ∶7.0（g/mL）料水比混合均勻后，加入液化酶（10 U/g），90 ℃液化90 min，冷卻到 60 ℃加入糖化酶 120、160、200 U/g 糖化 30 min，冷卻到 40 ℃，加蛋白酶 12 U/g 保持20 min，冷卻到30 ℃按3 ∶10 000 接種活化好的ADY，在 20 ℃發(fā)酵5 d 后蒸餾，發(fā)酵結(jié)束后測定酒度、酒中風(fēng)味物質(zhì)、殘還原糖、總酸，試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.4.1.4 蛋白酶添加量的確定

馬鈴薯雪花全粉：熱水（70℃左右）按照1∶7.0（g/mL）料水比混合均勻后，加入液化酶（10 U/g），90 ℃液化 90 min，冷卻到60 ℃加入糖化酶120 U/g 糖化30 min，冷卻到40 ℃，加蛋白酶 4、8、12 U/g 保持 20 min，冷卻到 30 ℃按3 ∶10 000 接種活化好的ADY，在20 ℃發(fā)酵5 d 后蒸餾，發(fā)酵結(jié)束后測定酒度、酒中風(fēng)味物質(zhì)、殘還原糖、總酸，試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.4.1.5 ADY 接種量的確定

馬鈴薯雪花全粉：熱水（70 ℃左右）按照1 ∶7.0（g/mL）料水比混合均勻后，加入液化酶（10 U/g），90 ℃液化90 min，冷卻到60 ℃加入糖化酶120 U/g 糖化30 min，冷卻到40 ℃，加蛋白酶4 U/g 保持20 min，冷卻到30 ℃按0.01%、0.05%、0.1%接種活化好的ADY，在20 ℃發(fā)酵5 d 后蒸餾，發(fā)酵結(jié)束后測定酒度、酒中風(fēng)味物質(zhì)、殘還原糖、總酸，試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.4.2 正交試驗設(shè)計

通過單因素試驗確定正交試驗的各因素水平，本試驗選取與高級醇的生成有直接關(guān)系的3 個因素：發(fā)酵溫度（A）、蛋白酶添加量（B）、ADY 添加量（C）設(shè)計發(fā)酵試驗因素水平表，如表1 所示。

表1 發(fā)酵試驗因素水平對照表L9（33）Table 1 Controlled table L9（33）for the level of experimental factors

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料水比對發(fā)酵醪液的影響

對于馬鈴薯雪花全粉來說，持水性較強(qiáng)[17]，考察料水比對醪液流動性和固形物濃度的影響，試驗結(jié)果見表2。

表2 不同料水比條件下醪液的特性Table 2 Characteristics of mash under different ratio of material to water

由表2 可知，料水比在 1∶5.5（g/mL）～1∶7.5（g/mL）范圍內(nèi)，固形物含量因加水量的增多逐漸降低，醪液形態(tài)也由黏稠變?yōu)檩^稀疏，流動性也增強(qiáng)。固形物濃度高，醪液流動性差，操作難度大，醪液固形物濃度太低，發(fā)酵后酒精濃度過低，從而降低生產(chǎn)效率，所以選取 1 ∶7.0（g/mL）的料水比，固形物濃度合適，醪液流動性好，易于操作。

2.1.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵理化指標(biāo)的影響

發(fā)酵溫度調(diào)控酵母繁殖快慢，影響代謝產(chǎn)物的生成以及原料的利用率，本次試驗結(jié)果見表3。

表3 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵理化指標(biāo)Table 3 Fermentation physicochemical indicators at different fermentation temperatures

由表3 可知，不同發(fā)酵溫度下，相同發(fā)酵初始固形物濃度條件下，發(fā)酵相同天數(shù)后，酒精度無明顯差異。與發(fā)酵溫度為20 ℃和25 ℃相比，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，產(chǎn)總酸高，溫度高，酵母繁殖速度快，同時伴隨的酸類代謝產(chǎn)物產(chǎn)生較快，發(fā)酵溫度20 ℃，剩余還原糖高于25 ℃和30 ℃，由于酵母繁殖相對較慢，導(dǎo)致發(fā)酵體系中的還原糖利用較慢。

2.1.3 發(fā)酵溫度對酒中主要風(fēng)味物質(zhì)的影響

溫度對酵母的繁殖起著重要作用，從而對酒的風(fēng)味產(chǎn)生影響，而風(fēng)味物質(zhì)除了釀酒原料自帶的一部分香氣外，大部分來自酵母的代謝產(chǎn)物，適量高級醇可以賦予酒體醇甜的味道，但過量的高級醇人飲用會使身體不適[18]，本次試驗結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on major flavor substances

由圖1 可知，發(fā)酵溫度主要影響著正丙醇、異丁醇、異戊醇的含量和乙酸異戊酯的含量，對于苯乙醇和乙酸乙酯的含量無明顯影響。隨著溫度的上升，酒中正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯類的含量逐漸上升，異戊醇的含量先上升后下降，總高級醇含量在30 ℃時最高，達(dá)到175.85 mg/L，25 ℃發(fā)酵時所產(chǎn)總高級醇含量與30 ℃相比無明顯差異為174.00 mg/L，20 ℃發(fā)酵時總高級醇含量最低為126.10 mg/L，相對較低的溫度一定程度上減緩了酵母的繁殖速度，從而使其生長過程中所產(chǎn)生的高級醇含量較低，綜合發(fā)酵理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)含量，選取20 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.4 糖化酶添加量對發(fā)酵理化指標(biāo)的影響

糖化提高了原料中淀粉向還原糖轉(zhuǎn)化的效率，提升了微生物的發(fā)酵狀態(tài)，從而提升了酒精的積累速度和總量[19]，控制糖化酶的添加量，相當(dāng)于控制發(fā)酵初始總糖，從而影響后面的發(fā)酵過程，并且控制生產(chǎn)成本，本試驗結(jié)果見表4。

表4 不同糖化酶添加量下發(fā)酵理化指標(biāo)Table 4 Fermentation physicochemical indicators with different glucoamylase additions

由表4 可知，在糖化溫度、糖化時間一定條件下，不同的糖化酶添加量對發(fā)酵液的初始糖度有影響，隨著糖化酶添加量的增大，發(fā)酵初始還原糖含量也逐漸增加，而對酒度、總酸、殘還原糖含量無明顯影響，說明糖化酶對發(fā)酵過程的影響不顯著。

2.1.5 糖化酶添加量對風(fēng)味物質(zhì)的影響

糖化酶影響著發(fā)酵初始總糖，可發(fā)酵性的糖為微生物的生長繁殖所必須，風(fēng)味物質(zhì)的形成又離不開微生物的代謝，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 糖化酶添加量對主要風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.2 Effect of glucoamylase addition on major flavor substances

由圖2 可知，糖化酶添加量從120 U/g～200 U/g 范圍內(nèi)，酒中正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、總高級醇含量無顯著性差異，添加量為200 U/g 時有乙酸異戊酯生成。綜合理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果，結(jié)合實際生產(chǎn)，選取120 U/g 為最佳糖化酶添加量。

2.1.6 蛋白酶添加量對發(fā)酵理化指標(biāo)的影響

蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)的肽鍵，從而為微生物生長提供氮源，白酒釀造過程中所產(chǎn)生的酸性環(huán)境，使用蛋白酶能較好的發(fā)揮作用，試驗結(jié)果見表5。

表5 不同蛋白酶添加量下發(fā)酵理化指標(biāo)Table 5 Fermentation physicochemical indicators with different additions of protease

由表5 可知，不同蛋白酶添加量對酒度、總酸、殘還原糖無顯著性影響，但蛋白酶的添加能避免發(fā)酵醪液溢出發(fā)酵容器，推測可能是蛋白酶對蛋白質(zhì)的分解，降低了發(fā)酵醪液的黏性，從而使酵母產(chǎn)生的二氧化碳能及時排出，使發(fā)酵正常進(jìn)行。

2.1.7 蛋白酶添加量對發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的影響

蛋白酶可以將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，滿足微生物的營養(yǎng)物質(zhì)需求，同時提供白酒香味的前體物質(zhì)[20]，試驗結(jié)果如圖3 所示。

圖3 蛋白酶添加量對酒中主要風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of protease dosage on on major flavor substances

由圖3 可知，隨著蛋白酶添加量的增大，酒中高級醇含量略微升高，添加量為12 U/g 時有乙酸異戊酯生成。考慮到實際生產(chǎn)，結(jié)合理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果，選取添加量為4 U/g 為最佳蛋白酶添加量。

2.1.8 ADY 接種量對發(fā)酵理化指標(biāo)的影響

發(fā)酵初始如果酵母接種量太小，容易染雜菌，酵母接種量過大，新增有活力的酵母比例較小，容易起發(fā)過猛，酵母易衰老，使發(fā)酵不徹底，試驗結(jié)果見表6。

表6 不同ADY 接種量下發(fā)酵理化指標(biāo)Table 6 Fermentation physicochemical indicators at different ADY inoculation quantities

由表6 可知，ADY 接種量從0.01%增加到0.1%，酒度、殘還原糖無明顯變化。總酸含量隨著接種量的提高而略微升高。酵母不處于它的最適溫度下生長，控制接種量不會對發(fā)酵理化指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響。

2.1.9 ADY 接種量對酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響

酵母菌的接種量對高級醇的生成存在一定程度的影響，發(fā)酵初始如果酵母接種量太小，會使得發(fā)酵醪液中的酵母增殖倍數(shù)太大，而高級醇合成的主要過程就是在酵母細(xì)胞自我繁殖過程中，所以生成的高級醇也會相應(yīng)較高。故在一定范圍內(nèi)上擴(kuò)大酵母接種量，可以在減少酵母的增殖代數(shù)，進(jìn)而降低高級醇的形成[21]。ADY 接種量對酒中主要風(fēng)味物質(zhì)的影響見圖4。

圖4 ADY 接種量對酒中主要風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.4 The effect of ADY inoculation amount on the major flavor substances of potato liquor

由圖4 看出，ADY 接種量對于苯乙醇、乙酸乙酯含量無明顯影響，而隨著接種量的提高，乙酸異戊酯的含量逐漸上升，ADY 接種量增大10 倍，乙酸異戊酯的含量提高82.47%。ADY 接種量為0.01%時，生成的總高級醇含量比0.05%高6.71 mg/L 左右、比接種量為0.1%高8.06 mg/L 左右，正丙醇、異丁醇、異戊醇均稍高于0.05%、0.1%。說明增值倍數(shù)確實對高級醇含量造成了一定的影響，但從經(jīng)濟(jì)效益來看，擴(kuò)大十倍的接種量，高級醇的減少量僅為4.8%，結(jié)合理化指標(biāo)，選取ADY 最佳接種量為0.01%。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以總高級醇含量為評價指標(biāo)，挑選與高級醇的產(chǎn)生有直接關(guān)系的3 個因素發(fā)酵溫度（A）、蛋白酶添加量（B）、ADY 添加量（C）進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見表7。

表7 正交試驗設(shè)計結(jié)果Table 7 Results of orthogonal experimental design

續(xù)表7 正交試驗設(shè)計結(jié)果Continue table 7 Results of orthogonal experimental design

由表7 中極差R 值可知，影響高級醇含量的因素主次順序為A＞B＞C，溫度是影響活性干酵母ADY 發(fā)酵過程產(chǎn)生高級醇含量高低的最主要因素，其次為蛋白酶添加量，然后為ADY 添加量，A1B2C1為最優(yōu)組合，即發(fā)酵溫度為18 ℃，蛋白酶添加量為4 U/g，接種量為0.005%，由于理論最佳配方不在9 組正交試驗中，而9 組正交試驗中高級醇含量最低的為A1B2C2，故對兩組不同工藝條件進(jìn)行驗證性試驗。

2.3 驗證性試驗結(jié)果

分別按照A1B2C1、A1B2C2組合進(jìn)行馬鈴薯雪花粉發(fā)酵試驗，分別做3 次重復(fù)試驗，二者酒精度均為5.3%vol，總高級醇含量分別為 103.23、105.58 mg/L，結(jié)合生產(chǎn)成本，選取接種量較小得A1B2C1為最優(yōu)組合，即發(fā)酵溫度為18 ℃，蛋白酶添加量為4 U/g，接種量為0.005%。

3 結(jié)論

本試驗以馬鈴薯雪花全粉為主要原料，通過單因素試驗以及正交試驗設(shè)計，分析得出各因素對總高級醇含量的影響，發(fā)酵溫度＞蛋白酶添加量＞ADY 接種量，并得到最佳發(fā)酵工藝為，料水比為1 ∶7.0（g/mL）、糖化酶添加量為120 U/g，蛋白酶添加量為4 U/g，接種量為0.005%，發(fā)酵溫度為18 ℃，按此工藝發(fā)酵，酒度適中，產(chǎn)高級醇含量較少。