超聲波輔助酶法提取青魚魚皮膠原蛋白工藝

王正云，蔣慧亮

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300）

膠原蛋白是動物結締組織中的主要成分，占哺乳動物體內蛋白質的25%～30%，在食品、醫藥、化妝品等領域已得到廣泛應用[1]。近年來，魚類產品的下腳料被大量丟棄，不利于環境保護并且會造成資源的浪費。

青魚（black carp）又名黑鯇、螺螄青，屬鯉形目、鯉科的雅羅魚亞科。主要分布于我國長江以南的平原地區，是長江中、下游和沿江湖泊里的重要漁業資源，2014 年全國養殖產量約為55.7 萬噸，為我國淡水養殖的“四大家魚”之一，青魚魚皮中含有豐富的膠原蛋白。

現有資料表明，酶法提取對膠原蛋白破壞性小，能更好、更完全地得到活性蛋白[2]。常用的酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，具有反應快、時間短、無污染等優點，同時超聲波提取因污染小、節能、環保等優點，已在當今生產、生活和科研等諸多領域被廣泛使用，在生物活性物質提取中具有良好的應用前景[3-4]。

目前國內外對青魚魚下腳料魚皮研究很少，對超聲波輔助提取青魚魚皮膠原蛋白工藝未見報道，本研究以青魚魚皮為原料，在超聲波輔助作用下，研究膠原蛋白的酶法提取工藝條件，為膠原蛋白相關產品的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青魚：市購；胰蛋白酶（250 U/g）、L-羥脯氨酸：上海潤成生物科技有限公司；對二甲基氨基苯甲醛、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司，為國產分析純。

1.2 主要儀器

754 紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；TDL-40B 臺式低速大容量離心機：金壇市金南儀器制造有限公司；EL20K 酸度計：梅特勒-托利多儀器有限公司；SHNS-SY-1000 超聲波提取器：北京中西遠大科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠原蛋白提取工藝流程

青魚魚皮的制備→NaOH 脫雜蛋白和脫色→正己烷去脂→水洗→超聲波輔助酶提取→滅酶→離心→膠原蛋白提取液[5]

1.3.2 膠原蛋白提取操作要點

1.3.2.1 青魚魚皮的制備

將活青魚去頭、去內臟，對剖成兩片后將魚皮與魚肉分離。將分離得到的魚皮去鱗、去鰭，清水沖洗干凈，陰涼處自然晾干，然后用剪刀將干凈的魚皮剪成碎片（5 mm×5 mm），放入密封袋封口后于-20 ℃凍藏備用。

1.3.2.2 青魚魚皮預處理

在4 ℃冰箱貯存條件下，用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡魚皮1 h 用來脫雜蛋白和脫色，用蒸餾水清洗后，在同樣溫度條件下再用2 倍體積的正己烷浸泡魚皮6 h 以去除脂肪，取出清洗后備用。

1.3.2.3 青魚魚皮膠原蛋白的提取

取預處理好的青魚魚皮，加入料液比為1∶20（g/mL）的一定pH 值的磷酸鹽緩沖溶液進行浸泡溶脹，溶脹12 h 進行勻漿，加入適量的胰蛋白酶溶液，放入一定功率的超聲波中處理一定時間，然后放入恒溫水浴鍋在35 ℃進行酶解提取，最后在100 ℃條件下滅酶10 min，冷卻后在4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液測定青魚魚皮膠原蛋白提取率[6-7]。

1.3.3 單因素試驗設計

試驗以膠原蛋白的提取率為目標參數，每組用量為5 g，以加酶量、超聲波處理時間、超聲波功率、酶解溫度、pH 值、酶解時間6 個因素進行單因素試驗。每個水平平行測定3 次取其平均值。

1.3.3.1 超聲波功率對膠原蛋白提取率的影響

在超聲波處理時間50 min、加酶量100 U/g、酶解溫度35 ℃、pH 7.5、酶解時間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設置超聲波功率分別為 300、400、500、600、700、800 W，研究超聲波功率對膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.2 超聲波處理時間對膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、加酶量100 U/g、酶解溫度35 ℃、pH 7.5、酶解時間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設置超聲波處理時間分別為 10、20、30、40、50、60 min，研究超聲波處理時間對膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.3 加酶量對膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時間50 min、酶解溫度35 ℃、pH 7.5、酶解時間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設置加酶量分別為 40、60、80、100、120、140 U/g，研究加酶量對膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.4 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時間50 min、加酶量100 U/g、pH=7.5、酶解時間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設置酶解溫度分別為 25、30、35、40、45、50 ℃，研究酶解溫度對膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.5 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時間50 min、加酶量100 U/g、酶解溫度35 ℃、pH 7.5 的條件下提取膠原蛋白，設置酶解時間分別為 3、4、5、6、7、8 h，研究酶解時間對膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.6 pH 值對膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時間50 min、加酶量 100 U/g、pH 7.5、酶解溫度 35 ℃、酶解時間 6 h 的條件下提取膠原蛋白，設置pH 值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，研究pH 值對膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.4 正交試驗設計

根據單因素試驗結果選取加酶量、酶解溫度、pH值、超聲波處理時間4 個因素為考察因素，設計四因素三水平的正交試驗。試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table in orthogonal experiment

1.3.5 魚皮膠原蛋白提取率的測定

羥脯氨酸為膠原蛋白特有氨基酸，通過測定提取液中羥脯氨酸的含量計算出魚皮膠原蛋白提取率。羥脯氨酸的測定參考國標：GB/T9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[8]。羥脯氨酸得率公式如下。

式中：W 為樣品中羥脯氨酸得率，%；C 為羥脯氨酸的標準液質量濃度，μg/mL；V 為提取液總體積，mL；f 為稀釋倍數；m1為原料質量，g；n 為換算系數（取0.1）。

青魚魚皮蛋白質含量測定參考國標GB5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的第一法凱氏定氮法[9]。青魚魚皮膠原蛋白提取率計算公式如下。

式中：X 為魚皮膠原蛋白提取率，%；w 為羥脯氨酸含量，g；11.1 為羥脯氨酸換算為蛋白質的系數；m2為魚皮蛋白質含量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波功率對膠原蛋白提取率的影響

超聲波功率對膠原蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 超聲波功率對膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on collagen extraction yield

由圖1 可知，當超聲波功率為300 W～600 W 之間時，膠原蛋白提取率與超聲波功率呈正相關，隨著超聲波功率的提高，大量溶劑滲透到細胞中，從而提高提取率。當超聲波功率達到600 W 時膠原蛋白提取率達到最高值。此后，提取率隨著超聲波功率的上升反而降低。這可能是由于功率過大的超聲波破壞了魚皮膠原蛋白的分子結構，從而導致膠原蛋白提取率下降[10-11]，因此本試驗條件下超聲波功率為600 W 時最佳。

2.1.2 超聲波處理時間對膠原蛋白提取率的影響

超聲波處理時間對膠原蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲波處理時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of supersonic extraction time on collagen extraction yield

由圖2 可知，隨著超聲波處理時間的延長，提取率不斷增大，當超過50 min 時，提取率幾乎不變。表明基本溶出全部膠原蛋白，但超聲波處理時間過長可能會造成體系溫度過高而降低酶的活性或破壞膠原蛋白的結構[12-13]。因此，初步選擇超聲波提取時間為40 min～50 min。

2.1.3 加酶量對膠原蛋白提取率的影響

加酶量對膠原蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 加酶量對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of amount of enzyme on collagen extraction yield

如圖3 所示，剛開始時膠原蛋白提取率隨著酶的加入量增大而顯著增大，幾乎呈線性關系，當加酶量超過100 U/g 之后，提取率略有下降。這可能是魚皮中膠原蛋白與酶結合已達到飽和，再增加酶用量時不再提高膠原蛋白提取率，甚至可能導致膠原蛋白降解而使提取率下降[14-15]。同時考慮到成本，酶用量選擇在80 U/g～120 U/g 為宜。

2.1.4 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響

酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of enzyme extraction temperature on collagen extraction yield

由圖4 可知，酶解溫度對膠原蛋白提取率具有雙重影響[16-17]，剛開始時隨著酶解溫度的提高，膠原蛋白提取率不斷上升，在35 ℃時達到最大值，但當酶解溫度繼續升高進行提取時，提取率直線下降，說明酶解溫度為30 ℃～40 ℃為胰蛋白酶的最適溫度范圍，超過此溫度酶活性會受到抑制，而降低膠原蛋白的提取率。

2.1.5 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響

酶解時間對膠原蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of amount of enzyme extraction time on collagen extraction yield

由圖5 可知，在酶解提取初期的4 h 內，膠原蛋白提取率較低，膠原蛋白還未充分溶于提取液中，隨后隨著酶解時間的延長，膠原蛋白提取率逐漸增加，當酶解時間達到6 h 時，膠原蛋白提取率達到最大值，此后提取率幾乎不再增加，說明膠原蛋白已基本提取完全，因此酶解時間在6 h 時膠原蛋白的提取效果最佳。

2.1.6 pH 值對膠原蛋白提取率的影響

pH 值對膠原蛋白提取率的影響見圖6。

由圖6 可知，在pH 值為7～8 時膠原蛋白提取率為最佳，低于或高于此pH 值范圍，膠原蛋白提取率均不理想，與胰蛋白酶活性酸度范圍一致。

2.2 正交試驗結果及方差分析

基于單因素的試驗基礎上進行四因素三水平的正交試驗，正交試驗結果見表2。

圖6 pH 值對膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of pH on collagen extraction yield

表2 正交分析結果表Table 2 Results of orthogonal analysis

采用L9（34）正交試驗確定青魚魚皮膠原蛋白的超聲波輔助酶提取最佳工藝[18-20]，由表2 極差分析可以看出：加酶量（A）、pH 值（B）、酶解溫度（C）、超聲波處理時間（D）4 個因素對魚皮膠原蛋白提取率影響的主次關系C＞D＞A＞B，即影響因素酶解溫度＞超聲波處理時間＞加酶量＞pH 值。最佳提取工藝為即A2B2C3D3，即加酶量100 U/g、pH 7.5、酶解溫度40 ℃、超聲波處理時間50 min，在最優條件下進行進行3 次平行驗證試驗，得膠原蛋白提取率為45.3%。

應用SPSS17.0 統計軟件對正交分析結果進行方差分析，分析結果見表3。

表3 正交試驗方差分析Table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

續表3 正交試驗方差分析Continue table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

由表3 可知，在影響膠原蛋白提取率的4 個因素中，酶解溫度對膠原蛋白提取率影響極顯著，加酶量和超聲波處理時間影響顯著，pH 值影響不顯著，與正交試驗極差分析結果基本一致。

3 結論

通過對各因素進行極差和方差分析表明：酶解溫度對膠原蛋白提取率為極顯著，加酶量及超聲波處理時間對膠原蛋白提取率高度顯著，pH 值對膠原蛋白提取率影響不顯著，各因素對膠原蛋白提取率影響大小依次為酶解溫度＞超聲波處理時間＞加酶量＞pH 值。通過正交試驗優化得到超聲波輔助酶提取青魚魚皮中膠原蛋白最優提取條件為加酶量100 U/g、pH 7.5、酶解溫度40 ℃、超聲波處理時間50 min。在此條件下膠原蛋白提取率為45.3%。