高效液相色譜法測定黃酒發酵醪液中生物胺含量

牛天嬌，郭永杰，孫二娜，馬鶯

（1.哈爾濱工業大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱150001；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京101107）

生物胺是一種由有機生物體產生的含氮的小分子堿性有機化合物的總稱，適量的生物胺是人體的正常活性成分[1]，而過量的生物胺則會引起血管、動脈的擴張，導致生物體出現頭疼、心慌、腹瀉、腹部抽搐和呼吸紊亂等一系列不良癥狀，嚴重時還會危及生命[2]。發酵食品中含有豐富的營養物質，具有大量的蛋白質，在蛋白酶和微生物的共同作用下會產生大量的生物胺，水產發酵制品[3]、肉制品[4]、乳制品[5]、酒中[6]均有生物胺，尤其是黃酒[7]中。

中國黃酒釀造歷史悠久，因其獨特的風味和高營養價值而深受國人的喜愛。黃酒主要以谷物、稻米等為原料，經過酵母、霉菌和細菌的共同發酵而成[8-10]。豐富的微生物體系產生大量的蛋白酶和氨基酸脫羧酶[11-12]，蛋白酶將黃酒發酵過程中的蛋白質分解為氨基酸，在氨基酸脫羧酶的進一步作用下經過脫羧反應形成大量生物胺[13]。而且，黃酒中的酒精會抑制生物胺降解酶-胺氧化酶的活性[14]，因此黃酒中存在較高的生物胺風險。為尋找控制黃酒中生物胺的方法，追蹤檢測整個發酵過程中發酵醪液的生物胺含量變化尤為必要。

根據現有報道，黃酒中生物胺含量的測定方法有很多，如高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法、生物傳感器法等[15-17]。目前，應用最為廣泛的是國標GB/T 5009.208-2016《食品中生物胺含量的測定》中的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法[18]。但是國標中針對酒類中生物胺的檢測方法是針對成品酒（液體）制定的，缺少針對黃酒發酵過程中發酵醪液（固液混合物）的生物胺含量測定方法。少數文獻中報道了黃酒醪液中生物胺的檢測，欒同青[19]采用了改進的高效液相色譜法測定黃酒發酵過程中生物胺含量，但其方法只對組胺、酪胺和腐胺3 種生物胺的分離效果較好。許祿等[20]建立了一種HPLC-MS/MS 的方法測定黃酒發酵過程中生物胺含量，但由于質譜儀檢測成本較高，應用受到限制。因此，本研究在酒類中生物胺檢測的國標方法基礎上，增加了三氯乙酸提取步驟，并簡化了流動相，建立了一種簡便可靠的針對黃酒發酵醪液中8 種常見生物胺的檢測方法并進行了驗證。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

在浙江紹興某黃酒廠采集不同批次黃酒發酵醪液樣品，每組樣品3 個平行。

1.1.2 化學試劑

色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、組胺、精胺、亞精胺鹽酸鹽標準品（純度均＞98%）、乙腈（色譜純）、丹磺酰氯（純度＞99%）：美國 Sigma 公司；正丁醇、三氯甲烷、鹽酸、三氯乙酸、丙酮、飽和碳酸氫鈉、氫氧化鈉、谷氨酸鈉、氯化鈉、無水乙醚（均為分析純）：天津市大陸化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

LC-20AT 高效液相色譜儀：日本島津有限公司；安捷倫C18 柱：上?？茣钥茖W儀器有限公司；DC-12型氮吹儀：上海安譜實驗科技股份有限公司；DK-8B型恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備公司；MS2 型渦旋振蕩器：德國IKA 公司；Sigma 3K30 型低溫高速離心機：德國 Satorious；UF/UVPL5124 超純水儀：美國 Pall 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣

浙江紹興某黃酒廠采集7 個不同批次的黃酒發酵醪液樣品，采集樣品存放在滅菌瓶子中冷凍運輸和保存。

1.3.2 高效液相色譜法測定生物胺含量

1.3.2.1 樣品的前處理

取黃酒發酵醪液10.00 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液并振蕩提取30 min，轉移至50 mL 具塞離心管中，5 000 r/min 離心10 min，轉移上清液至50 mL 容量瓶中。移取上清液15 mL，加入適量的NaCl 使溶液飽和。稱取飽和后的樣品溶液5 mL，置于10 mL 具塞離心管中，加入0.65 mL2.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH 值至12.0 左右。加入5 mL 等比例混合的正丁醇和三氯甲烷溶液，渦旋振蕩5 min，5 000 r/min 離心5min，轉移上層有機相于另一個10 mL具塞離心管中，下層樣液再萃取一次，合并萃取液，用等比例混合的正丁醇和三氯甲烷溶液稀釋至刻度。取5 mL 萃取液加入 200 μL 鹽酸（1 mol/L），混合后 40 ℃水浴下氮氣吹干，加入1 mL 鹽酸（0.1 mol/L）渦旋振蕩，使殘留物完全溶解，待衍生[18]。

1.3.2.2 樣品的衍生

在待衍生試樣中依次加入1 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、1 mL 丹磺酰氯衍生試劑，渦旋混勻1 min 后置于60 ℃恒溫水浴中衍生15 min，取出，加入100 μL 谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應15 min。取出冷卻至室溫25 ℃，于每個離心管中加入1 mL 水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮（約1 mL），加入0.5 g 氯化鈉渦旋振蕩至氯化鈉完全溶解后加入5 mL 乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，吸出上層有機相（乙醚層），再萃取一次，合并乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL 乙腈渦旋振蕩使殘留物完全溶解，0.22 μm 濾膜針頭濾器過濾于進樣小瓶，待測定[18]。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫 C18柱（5 μm，150 mm×4.6 mm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣 20 μL；紫外檢測波長為254 nm；流動相A 為乙腈，流動相B 為超純水，梯度洗脫程序見表1。標準品譜圖和樣品譜圖見圖2 和圖3。

1.3.2.4 生物胺標準曲線的繪制

分別吸取1.0 mL 各生物胺標準儲備液置于10 mL離心管中，用0.1 mol/L HCl 溶液稀釋至5 mL，混勻，得到濃度為200 mg/L 的生物胺標準液。分別吸取0.05、0.30、0.5、1.25、2.5、5、7.5 mL 上述制得的濃度為200 mg/L 的各生物胺標準液于10 mL 離心管中，用0.1 mol/L HCl 溶液稀釋至10 mL，混勻，使濃度分別為1、6、10、25、50、100、150 mg/L。取各系列生物胺標準液1.0 mL，柱前衍生后，利用高效液相測定其生物胺含量，以生物胺含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制8 種生物胺的標準曲線。

表1 HPLC 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

圖1 生物胺HPLC 標準品譜圖Fig.1 HPLC chromatographic profile of a biogenic amines standard solution

圖2 生物胺HPLC 樣品譜圖Fig.2 HPLC chromatographic profile of a biogenic amines sample solution

1.3.2.5 精密度試驗

取10 mg/L 的混合標準樣品，根據1.3.2.2 方法對其進行衍生，然后在1 d 內和連續3 d 分別進行相同衍生標品的6 次的進樣試驗，測定8 種生物胺含量，根據結果計算保留時間相對標準偏差和質量濃度相對標準偏差。

1.3.2.6 加標回收率試驗

在黃酒樣品中加入濃度為10 mg/L 的混合生物胺標準品工作液，平行測定6 次，計算8 種生物胺的加標回收率。

1.3.2.7 數據處理

黃酒樣品均以3 個獨立的方式制備，每個樣品平行測定3 次。采用SPSS19.0 軟件計算實驗結果的均值和標準偏差，同時進行方差分析，方差分析如無特殊說明均為P<0.05 時具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程、檢出限和定量限

將濃度為 1、6、10、25、50、100、150 mg/L 的生物胺標準溶液按照次序進樣，根據各標準品的峰面積（y）對對應的標準溶液質量濃度（x）作標準曲線，計算標準曲線的回歸方程和相關系數，檢出限的判斷標準為信噪比（S/N）＞3，定量限的判斷標準為信噪比＞10，結果見表2。

由表2 可知，8 種生物胺的線性范圍在0.5 mg/L～20 mg/L，線性相關系數R2均≥0.999，說明符合測定的要求。苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的檢出限的范圍為0.187 mg/L～0.317 mg/L，定量限的范圍是0.323 mg/L～0.887 mg/L，而色胺的檢出限為0.35 mg/L，定量限為1.06 mg/L。從結果可以看出該方法對8 種生物胺（色胺除外）靈敏度高，能滿足樣品測定的要求。

表2 生物胺回歸曲線、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Regression equations of the standard curve，correlation index，linearity range，detection limit and quantification limit of biogenic amines derivatives

2.2 精密度試驗

精密度試驗的保留時間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）和質量濃度相對標準偏差，結果如表3 所示。

表3 精密度試驗結果Table 3 Results of precision tests

由表3 可知，保留時間相對標準偏差值均＜1%，色胺、苯乙胺、腐胺、組胺、亞精胺和精胺的質量濃度的相對標準偏差值均＜5 %，說明精密度符合檢測的要求。

2.3 加標回收率試驗

8 種生物胺的加標回收率結果見表4。

由表4 可知，8 種生物胺的加標回收率范圍為95.31 %～105.22 %，其回收率的RSD 值均＜10 %，因此，該方法準確可靠，可用于檢測黃酒中生物胺的種類和含量。

表4 黃酒樣品中生物胺的加標回收率試驗結果Table 4 Results of recovery rate tests of biogenic amines in Chinese rice wine samples

2.4 黃酒發酵醪液中生物胺分析

在浙江紹興某黃酒廠采集7 個不同批次的黃酒發酵醪液進行生物胺含量的檢測，檢測結果如表5 所示。

由表5 可見，在黃酒發酵醪液中，8 種生物胺均能檢出，總生物胺的范圍是151.02 mg/L～181.48 mg/L，不同樣品之間總生物胺含量差異不大。這可能是因為黃酒發酵醪液樣品是在同一酒廠的鄰近批次采集，由于生產環境和生產工藝較為固定，因此其生物胺總量較為接近。在所檢測的8 種生物胺中，黃酒中主要的生物胺為腐胺、酪胺，其中腐胺的含量范圍為75.52 mg/L～99.44 mg/L（占總生物胺的49.95%～54.79%），酪胺的含量范圍為52.74 mg/L～86.22 mg/L（占總生物胺的34.92%～48.48%），另外6 種生物胺含量較低（ND～7.05 mg/L）。這與食品中常見的微生物脫羧酶主要是酪氨酸脫氫酶和鳥氨酸脫氫酶一致[18]，其對應的生物胺分別為酪胺和腐胺。

表5 黃酒發酵醪液中生物胺含量Table 5 Biogenic amine content in fermentated mash of yellow rice wine samples mg/L

3 結論

本文建立了黃酒發酵醪液中固液混合物生物胺的分析方法并測定了紹興某黃酒廠發酵醪液固液混合物的生物胺含量。8 種生物胺的檢出限為0.187 μg/L～0.35 μg/L，定量限為 0.323 μg/L～1.06 μg/L，且在0.5 μg/L～20 μg/L 范圍內具有良好的線性關系。8 種生物胺在黃酒發酵醪液樣品中的平均回收率為95.31%～105.22%，相對標準偏差在3.21%～9.87%，均小于10%，符合國家標準中殘留檢測要求。該方法為黃酒發酵醪液（固液混合物）中生物胺的測定提供了簡便可靠的方法。在黃酒發酵醪液中，8 種生物胺均能檢出，總生物胺的范圍是151.02 mg/L～181.48 mg/L。在所檢測的8 種生物胺中，黃酒中主要的生物胺為腐胺和酪胺。