硫醇轉移酶基因敲除小鼠模型的建立及其白內障形成機制

張 婕，嚴 宏，Marjorie F.Lou

0 引言

年齡相關性白內障可由多種因素誘發，包括氧化損傷、紫外線輻射、高血糖、吸煙及遺傳等。氧化損傷是其中最重要的發病因素。研究證實，在年齡相關性白內障的晶狀體中，含巰基的抗氧化物和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平急劇下降，含巰基的蛋白質廣泛被氧化，形成蛋白質與GSH形成的二硫化物(protein-GSH mixed disulfides，PSSG)或蛋白質與蛋白質形成的二硫化物(protein-protein mixed disulfides，PSSP)；細胞質和細胞膜間的大量結合蛋白轉化為不可溶性蛋白；細胞膜內大部分脂質被氧化，以上這些都是導致白內障發生的原因[1]。

硫醇轉移酶(thioltransferase，TTase)也稱為谷氧還蛋白1(glutaredoxin 1，Grx1)，它是巰基-二硫化物的氧化還原酶家族中一個非常重要的成員。1974年首次在大鼠肝細胞發現[2]，隨后在大腸桿菌E.coli中發現[3]，并且得到廣泛的研究。哺乳動物中Grx兩種最主要的同工酶，TTase(Grx1)主要存在于細胞質中[4-5]，Grx2存在于線粒體中[6]，Grx2的功能尚未完全闡明。TTase通過斷裂晶狀體蛋白質氧化形成的二硫鍵(PSSG)使硫醇化的蛋白質脫硫醇，保持晶狀體蛋白和膜蛋白的還原狀態，從而阻止它們交聯失活，同時可以通過調節酶活性中心的巰基來修復氧化損傷的酶，從而防止白內障的產生[4-5]。本研究通過建立硫醇轉移酶基因敲除小鼠模型，觀察其晶狀體形態和生化方面隨年齡的改變，探討TTase在晶狀體氧化還原系統中的生理作用及在年齡相關性白內障發生發展過程中的重要性。

1 材料和方法

1.1材料主要實驗試劑：REDExtract-N-Amp Tissue PCR試劑盒、胎牛血清、GSH含量測定試劑盒(美國Sigma公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司)，抗PSSG單克隆抗體(美國ViroGeng公司)，抗GAPDH單克隆抗體、抗Beta-actin單克隆抗體、山羊抗鼠IgG2a(美國Santa Cruz公司)，His-band試劑盒(美國QIAGEN公司)，其他試劑均為國產分析純試劑。主要儀器設備：裂隙燈(美國Zeiss公司)、離心機(美國Eppendorf公司)，PCR儀、電泳儀、電轉儀、化學發光成像儀(美國Bio-Rad公司)，紫外分光光度計(美國Beckman Coulter公司)。

圖1小鼠TTase基因敲除過程。

1.2方法

1.2.1建立TTase基因敲除小鼠模型TTase基因敲除過程見圖1，該過程是與南京大學-南京生物醫藥研究院合作完成。小鼠TTase基因序列包括3個外顯子，第1、2外顯子為蛋白質編碼區，且第2外顯子為GSH結合部位，第3外顯子為3’-非編碼區。從129SV小鼠文庫中克隆出TTase基因組片段，用外源性載體序列(Neo)替換，敲除片段包含了第2個外顯子和第1、2內含子的部分片段。打靶載體用Not I酶切線性化后，轉入R1胚胎干細胞[來源(129SVx129SVJ)F1]，經過篩選，得到陽性克隆。將篩選成功的克隆細胞植入C57BL/6小鼠的囊胚細胞，進行至少兩代遺傳，由雜合子(TTase+/-)[遺傳背景為(129SVx129SVJ)F1和C57BL/6]小鼠交配后產雜合子、野生型和基因敲除型三種基因型小鼠，采用PCR的方法對其基因型進行鑒定，最后得到TTase基因敲除型小鼠(TTase-/-)[7]。實驗動物在清潔級層流動物房內進行飼養繁殖，小鼠籠、水、食物、墊料等均經消毒處理。采用1只公鼠和1只母鼠交配繁殖后代。母鼠的孕期大約是20d，生育小鼠發育良好。本研究過程中動物管理符合動物保護條例，并經倫理委員會批準。

1.2.2小鼠基因型鑒定采用REDExtract-N-Amp Tissue PCR試劑盒進行小鼠基因組DNA抽提，并采用PCR擴增的方法對所有小鼠基因型進行鑒定。

1.2.3裂隙燈觀察小鼠晶狀體混濁情況分別取不同年齡(1、4、9、12、16月齡)TTase基因敲除型和野生型小鼠，0.5%托吡卡胺和0.5%去氧腎上腺素眼液聯合散瞳，15min后在裂隙燈下觀察每只小鼠雙眼晶狀體混濁程度，并根據晶狀體混濁分級系統II(LOCSII)[8]進行分級，分析不同基因型小鼠隨年齡增長白內障發生情況。

1.2.4小鼠晶狀體可溶性蛋白質的提取與定量小鼠處死后，立即取出眼球，分離晶狀體并稱重，置于干冰上冷凍干燥，-80℃保存待用。加組織裂解液于1～2mL勻漿器中，將晶狀體置于勻漿器中勻漿，并置于冰上，重復研磨使組織盡量碾碎，裂解30min后，用移液管將裂解液移至1.5mL離心管中，在4℃下13000r/min離心10min，離心2次，取上清置于-80℃保存。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質的總濃度。

1.2.5小鼠晶狀體GSH含量的測定取晶狀體組織勻漿液于1.5mL離心管中，加等體積20%三醋酸纖維素(TCA)混合，使終濃度為10%，在4℃下13000r/min離心10min，離心2次，取上清備用。按試劑盒說明書測定晶狀體GSH含量。

1.2.6 Western blot檢測小鼠晶狀體PSSG蛋白質的表達將提取的晶狀體組織勻漿液進行12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜及脫脂牛奶封閉，之后于4℃冰箱內與一抗(1∶1000抗PSSG單克隆抗體)孵育過夜，室溫漂洗后給予二抗(1∶4000 HRP標記的山羊抗鼠IgG2a)封閉液中孵育1h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，于發光成像儀Versadoc進行化學發光及成像并進行蛋白條帶的光密度掃描。

圖2小鼠基因型PCR鑒定結果M：Marker；1～6：小鼠編號。WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。

1.2.7免疫共沉淀法檢測形成PSSG的蛋白質每管中加入20μL晶狀體組織勻漿液，加入RIPA緩沖液至100μL，加入5μg抗體(抗Beta-actin/GAPDH單克隆抗體)，在混勻器上4℃勻速旋轉過夜。每管中加入50μL Beta-actin/GAPDH beads，在混勻器上4℃勻速旋轉2h。將免疫沉淀后的溶液于4℃ 2500r/min離心10min，收集上清，加入500μL RIPA緩沖液洗滌beads，4℃ 2500r/min離心10min，棄上清，共洗滌3次。在洗滌完畢的beads中加入2×SDS加樣緩沖液，于100℃煮沸3min后進行Western blot檢測(方法同前)。

1.2.8重組人晶狀體TTase的分離純化及脫硫醇作用檢測選取轉化的攜有重組表達質粒pET23a(+)的大腸桿菌單菌落于5mL LB(Amp+)培養液中，37℃振蕩培養過夜后，測量600nm下吸光光度值，收集4 OD/mL細胞，轉移至100mL LB(Amp+)培養液中32℃振蕩培養，待吸光光度值達0.6 OD/mL (2～3h)加入IPTG，42℃誘導6h，4℃下3000r/min離心30min收獲菌體。同時收取少量表達產物進行全蛋白12% SDS-PAGE分析。離心收集沉淀加入5mL BugBuster和5μL Nucleas懸浮，室溫下緩慢搖勻10min，避免氣泡。4℃下15000r/min離心30min收集上清。上清經His-band純化試劑盒進行洗脫。將重組液超濾濃縮至2～3mL，-80℃保存。采用12% SDS-PAGE凝膠電泳分析重組蛋白的純化過程。取晶狀體組織勻漿液，分別與還原型GSH(終濃度為5、10mmol/L)或純化的重組人晶狀體TTase(recombinant human lens TTase，RHLT)0.1U在30℃水浴反應30min。反應后加入5×SDS加樣緩沖液，于100℃煮沸3min后進行Western blot檢測(方法同前)。

表1 兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量

2 結果

2.1小鼠基因型鑒定及生長情況不同基因型小鼠基因鑒定的PCR電泳結果見圖2，TTase基因敲除型小鼠擴增出第一對引物(Neo)，野生型小鼠擴增出第二對引物(TTase)。TTase基因敲除型小鼠和野生型小鼠生長狀況良好，目前為止最長觀察1mo發現，兩種基因型小鼠在體質量、習性及生長發育方面均非常相似。

2.2不同基因型小鼠白內障發生情況在TTase基因敲除型和野生型小鼠中，白內障的發生均隨著年齡增加而增加，混濁類型主要為核性，見圖3。在TTase基因敲除型小鼠中，晶狀體混濁最早從4月齡發生，可見晶狀體核點狀混濁，9月齡晶狀體核混濁明顯加重；而野生型小鼠晶狀體混濁最早從9月齡發生，12月齡明顯加重。16月齡時兩種基因型小鼠晶狀體均發展為成熟期白內障。

4月齡TTase基因敲除型小鼠白內障發病率為26%(10/38眼)，野生型小鼠晶狀體均透明(0/22眼)；9月齡TTase基因敲除型小鼠白內障發病率增加至78%(22/28眼)，野生型為40%(8/20眼)；12月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體均發生混濁(18/18眼)，野生型發病率為50%(16/32眼)；16月齡兩種基因型小鼠晶狀體均出現明顯混濁(TTase基因敲除型20/20眼；野生型12/12眼)。

2.3不同基因型小鼠晶狀體GSH含量變化觀察不同年齡(1、4、9、16月齡)TTase基因敲除型和野生型小鼠晶狀體中GSH含量發現，兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量均隨著年齡增加而降低，且9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體中GSH含量明顯低于野生型，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖4。

2.4不同基因型小鼠晶狀體PSSG蛋白質的表達觀察不同年齡(1、4、9、16月齡)TTase基因敲除型和野生型小鼠晶狀體PSSG蛋白質的表達發現，兩種基因型小鼠晶狀體中PSSG蛋白質的表達均隨著年齡增加而升高，且形成的PSSG蛋白質主要集中在分子量37～50kDa和100kDa以上。比較兩種基因型小鼠晶狀體PSSG蛋白質表達灰度值發現，4月齡(P<0.05)和9月齡(P<0.01)TTase基因敲除型小鼠晶狀體中高分子PSSG(100kDa以上)蛋白質表達明顯高于同年齡野生型小鼠(圖5)。

2.5免疫共沉淀法鑒定形成PSSG的蛋白質Western blot可見PSSG條帶主要集中在分子量37～50kDa，與骨架蛋白Beta-actin(42kDa)和GAPDH(37kDa)分子量相似，因此利用免疫共沉淀法檢測形成PSSG的蛋白質。取組織裂解液分別用抗Beta-actin和抗GAPDH進行免疫沉淀反應，免疫沉淀物經SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，并用抗Beta-actin和抗GAPDH抗體進行Western blot。結果發現，在免疫沉淀產物中可以檢測到Beta-actin和GAPDH，證實形成氧化產物PSSG中的蛋白質包含Beta-actin和GAPDH(圖6)。

圖3裂隙燈觀察不同年齡兩種基因型小鼠晶狀體混濁情況1月齡TTase基因敲除型和野生型小鼠晶狀體均透明；4月齡基因敲除型小鼠晶狀體開始發生核點狀混濁，而野生型小鼠晶狀體仍然保持透明；9月齡基因敲除型小鼠可見核性混濁及空泡和小水裂，而野生型小鼠晶狀體僅可見輕度的混濁；12～16月齡兩種基因型小鼠晶狀體混濁均加重，逐漸發展為成熟期白內障，包括皮質和后囊下混濁。紅色箭頭示小鼠晶狀體核混濁部位。

圖4不同年齡兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。aP<0.05vs野生型。

圖5Western blot分析不同基因型小鼠晶狀體PSSG蛋白質表達A：Western blot檢測結果；B：不同基因型小鼠晶狀體PSSG 37～50kDa蛋白條帶光密度掃描統計圖；C：不同基因型小鼠晶狀體PSSG 100kDa以上蛋白條帶光密度掃描統計圖。WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。aP<0.05，bP<0.01vs野生型。

圖6免疫共沉淀法鑒定形成PSSG的蛋白質A：免疫共沉淀鑒定Beta-actin；B：免疫共沉淀鑒定GAPDH。Pellet:免疫沉淀物；Supernatant：上清；WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。

2.6重組人晶狀體TTase的脫硫醇作用取9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體裂解液，分別與5、10mmol/L GSH或同時加入純化的RHLT 0.1U反應，形成的PSSG可被還原劑GSH還原，而加入純化的TTase后，更多硫醇化的PSSG可被還原，證明TTase具有脫硫醇作用(圖7)。

3 討論

晶狀體的氧化損傷是年齡相關性白內障形成的重要因素[1,9]。晶狀體中有多重抗氧化屏障，其中包括2種主要蛋白質/酶修復系統：(1)GSH依賴的TTase/Grx系統，通過切斷晶狀體蛋白質和GSH硫醇化形成的二硫化物(PSSG)維持晶狀體的還原狀態[10]；(2)NADPH依賴的硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)系統，可以有效還原蛋白質和蛋白質之間形成的二硫鍵(PSSP)[11-12]。這些抗氧化系統可以獨立或聯合發揮作用，保持晶狀體的氧化還原平衡，從而防止白內障的形成。本研究通過建立TTase基因敲除小鼠模型，觀察其白內障的發生情況，進一步探討TTase在白內障發病中的保護機制。

圖7Western blot分析TTase的脫硫醇作用control：TTase基因敲除小鼠晶狀體裂解液，未加入 GSH或純化的TTase。

小鼠TTase基因序列包括3個外顯子，其中GSH結合氨基酸位點編碼于第2外顯子，本研究通過敲除第2外顯子建立TTase基因敲除小鼠模型。Western blot檢測結果顯示，TTase基因敲除型小鼠晶狀體上皮細胞及其他組織如腦、心、腎均無TTase表達[7]。目前觀察TTase基因敲除型小鼠在體質量、習性及生長發育方面與野生型小鼠都非常相似。兩種基因型小鼠白內障的發生均呈年齡相關性，且混濁部位表現為核性混濁。TTase基因敲除型小鼠中白內障最早從4月齡開始發生，9月齡明顯加重；而野生型小鼠最早從9月齡開始發生，12月齡時明顯加重。至16月齡時，兩種基因型小鼠晶狀體均發生明顯混濁。結果提示TTase基因敲除可以加快年齡相關性白內障的發生。

GSH 是晶狀體中重要的還原物，其可以通過一系列代謝反應和抗壞血酸不斷產生[13]。GSH的損失是發生老化和白內障形成的重要標志之一[1]。比較兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量發現，GSH均隨年齡增加而降低，且9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體中GSH含量明顯低于野生型，分析與兩種基因型小鼠白內障的發生相關，9月齡TTase基因敲除型小鼠白內障的發生率明顯高于同年齡野生型小鼠。結果提示TTase基因敲除可以加速GSH的損失。

本課題組前期進行細胞和動物實驗研究發現，TTase等抗氧化酶在紫外線(UV)照射后表達上調，說明TTase在抵抗晶狀體蛋白質免受紫外線等氧化損傷方面發揮重要作用[14-16]。研究發現，在年齡相關性白內障(包括核性、皮質性、混合性)患者的晶狀體中，TTase的活性明顯下降[17]。TTase的重要功能之一是通過脫硫醇作用來還原氧化損傷后的蛋白質或酶形成的PSSG，從而修復其功能或活性。PSSG的形成可以使蛋白質結構發生改變，且晶狀體中PSSG的積聚可以引起蛋白質和蛋白質之間二硫鍵的形成和交聯，最終導致白內障的發生[18]。在本研究中兩組基因型小鼠晶狀體PSSG均隨年齡增加而增加，且9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體中PSSG表達明顯高于同年齡野生型小鼠，主要為高分子聚合物，分析與白內障的發生情況相關。

本研究發現，硫醇化形成PSSG的蛋白質之一為肌動蛋白(actin)，其是一條由多肽鏈構成的分子量為42kDa的球型分子，與肌球蛋白結合構成微絲后有多種生物學功能，如構成細胞骨架、維持細胞形狀；參與細胞運動、分泌等活動；參與細胞內信號的傳遞；參與蛋白質的合成等。大量研究表明，肌動蛋白因含有大量巰基而易被氧化損傷[19]。另一種被硫醇化的蛋白質為GAPDH(37kDa)，它在糖酵解途徑中對氧化損傷最敏感。GAPDH有4個亞基，每個亞基都包括4個巰基(-SH)，其中2個巰基位于活性中心(Cys-149)，而活性中心的氧化會導致其酶活性的喪失[20]。由于晶狀體屬于無氧代謝，這種代謝在晶狀體中尤為重要。Xing等[21]發現晶狀體上皮細胞與低濃度H2O2孵育后，GAPDH可以和GSH被硫醇化生成PSSG。抵抗氧化損傷引起的細胞毒性及發生永久性修飾，這種硫醇化反應也對GAPDH及其他酶起到保護作用[22]。本研究表明，形成硫醇化的肌動蛋白及GAPDH可被還原劑GSH還原。而加入純化的TTase后，更多硫醇化的PSSG被還原。證實了這些條帶是形成二硫化物的蛋白質，證明TTase通過斷裂氧化形成的二硫鍵，使晶狀體中硫醇化的蛋白質脫硫醇，阻止它們交聯失活，從而使晶狀體蛋白以及膜蛋白保持還原狀態，防止白內障的產生。

綜上所述，本研究通過建立TTase基因敲除小鼠模型，發現TTase基因敲除可以加速小鼠白內障的發生。晶狀體中PSSG的聚積隨年齡的增加而增加，且與晶狀體的混濁程度相關。這種形成二硫化物的蛋白質主要是肌動蛋白和GAPDH，且可被GSH聯合RHLT還原，證實了TTase的脫硫醇作用。